Seleccionar fragmentos de anticuerpos para la terapia con células CAR-T de la biblioteca de presentación de fagos

 

Seleccione fragmentos de anticuerpos para la terapia con células CAR-T de la biblioteca de presentación de fagos. La contraparte de CAR que se une al antígeno es el fragmento de anticuerpo scFv (fragmento variable de cadena única), que puede reconocer proteínas de membrana asociadas con células cancerosas.

En este capítulo, se analiza el uso de la biblioteca de presentación de fagos scFv humanos como fuente de nuevos anticuerpos monoclonales contra antígenos de superficie. Se propuso un esquema de uso intensivo del dominio extracelular de proteínas de superficie en forma de biotinilación como antígeno selectivo.

Describe la elución con péptidos sin marcar y la selección en solución. También describe el uso de NGS para analizar el scFv enriquecido durante todo el proceso de selección. Teniendo en cuenta estos esquemas de manera integral, se pueden aislar nuevos scFv y estos nuevos scFv se pueden usar para construir nuevos receptores de antígenos quiméricos para el tratamiento del cáncer.

Las células T del receptor de antígeno quimérico (CAR-T) son linfocitos T que producen proteínas de membrana recombinantes que imitan inmunoglobulinas unidas a uno o más dominios de activación basada en tirosina de inmunorreceptores (ITAM). Sitio de unión al antígeno [1, 2].

La proteína quimérica asocia la unión de un antígeno específico con la señal de activación en el citoplasma de la célula T, lo que desencadena una respuesta efectora a la célula portadora de antígeno. Las células CAR-T se obtienen normalmente mediante la transducción de células T vírgenes con vectores de expresión lentivirales del receptor de antígeno quimérico, y las células CAR-T se han convertido en una gran esperanza para estimular el sistema inmunológico contra las células tumorales elásticas [3].

La elección de anticuerpos de alta afinidad contra antígenos específicos del cáncer es una de las claves para un sistema CAR-T eficaz [4]. En este capítulo, discutimos el uso de la tecnología de presentación de fagos para aislar secuencias codificantes de anticuerpos que se usarán en vectores de expresión CAR.

En 1985, George Smith, ganador del Premio Nobel de 2018, publicó el primer informe sobre la tecnología de presentación de fagos, que puede seleccionar conjuntamente polipéptidos y sus respectivos genes codificadores [5]. Smith ha demostrado que es posible clonar fragmentos de ADN extraño y fusionarlos con el gen III del fago filamentoso para formar una fusión que exhibe un origen extraño en el extremo N de la proteína III (el extremo de la cápside del fago). Incluso si contiene péptidos extraños, la proteína III todavía puede mantener sus funciones fisiológicas y conservar la viabilidad de los bacteriófagos [6]. Además, esta fusión permite que el péptido recombinante interactúe con el objetivo y los ligandos externos [7].

La visualización de la biblioteca de anticuerpos en fagos es una técnica poderosa para separar los anticuerpos antigénicos anticancerígenos [8]. Este método es particularmente útil en el caso de bibliotecas combinatorias de anticuerpos, donde las regiones codificantes de VH y VL se combinan para codificar millones de fragmentos de anticuerpos, scFv o Fabs, que se muestran en la superficie del fago filamentoso [9,10]. En este caso, cada clon corresponde a un fragmento de anticuerpo monoclonal (mAb), que puede seleccionarse en función de su especificidad y afinidad [11-13].

En tales procedimientos, la atención se centra en la selección de anticuerpos que reconocen los antígenos del cáncer humano. La opción más común es la construcción de bibliotecas ingenuas [14], porque es difícil obtener anticuerpos contra autoantígenos. Estas bibliotecas están compuestas por los genes VH y VL de tres o más individuos. En este caso, aparecerán nuevas especificidades y se pueden hacer más opciones. El éxito de la selección depende de dos pasos importantes: la tasa de conversión inicial que determina el tamaño de la biblioteca y el procedimiento de selección que puede mejorar la especificidad y facilitar la selección de anticuerpos monoclonales de mayor afinidad.

Como contraparte de reconocimiento de antígenos de CAR, la selección debe basarse en la capacidad de scFv para unirse a la proteína asociada a la membrana de la célula diana. Se han informado algunas estrategias para seleccionar anticuerpos contra proteínas de la superficie celular.
Entre estos métodos, algunos protocolos utilizan células incubadas con bibliotecas de presentación de fagos para la clasificación [15].

Otro método para aislar mAb contra proteínas de la superficie celular es mediante centrifugación de la parte inferior orgánica inmiscible con respecto a la suspensión de fagos / células. Este método se llama BRASIL (Biopanning y análisis rápido de ligando selectivo e interactivo) [16, 17]. Sin embargo, en ambos métodos, cualquier proteína de superficie específica puede impulsar la selección, en lugar de una proteína específica relacionada con el fenotipo del tumor. Por lo tanto, idealmente, para las construcciones CAR, los antígenos asociados al cáncer bien conocidos deberían desencadenar la selección de mAb humanos.

Un método alternativo es utilizar péptidos que representan el dominio extracelular de proteínas asociadas al cáncer de superficie como antígenos inmovilizados. En este capítulo, recomendamos utilizar este péptido marcado con biotina para facilitar su fijación o selección en solución.

Usando esta estrategia, el fago unido también puede eluirse con péptidos no marcados. Este método debería ilustrar una selección de scFv más específica. Junto con estos protocolos, se propuso un procedimiento para generar amplicones de mAb seleccionados para secuenciar las secuencias de codificación VH y VL enriquecidas por NGS (Next Generation Sequencing).

 

Algunos consejos:

• ⦁ Se pueden construir bibliotecas combinatorias de anticuerpos a partir de las bibliotecas VH y VL de individuos que han obtenido ADNc de células sanguíneas periféricas (PBMC) o incluso de otra médula ósea (como la médula ósea) [26]. Las secuencias codificantes de VH y VL se combinan mediante PCR en forma de scFv o Fab, compatibles con la presentación en la superficie del fago filamentoso y fusionadas con la proteína III. También se ha informado de la construcción de bibliotecas sintéticas [27]. En estos casos, la variabilidad se limita casi a los dos dominios de CDR3.

 

• Se pueden usar diferentes cepas E de bacterias coliformes. Los bacteriófagos filamentosos que expresan fimbrias intestinales de la familia Enterobacteriaceae (de la familia Inoviridae) infectan bacterias [28]: E. coliharbor F se une a diferentes cepas de plásmidos. Las cepas más utilizadas son TG1, ER2537 y XL1-Blue. Si usa la cepa XL1-Blue, puede asegurarse de que haya un plásmido F integrado en el genoma. Una vez en esta cepa, el plásmido también lleva un transposón con un gen de resistencia a la tetraciclina: [F0proAB, lacIqZΔM15Tn10 (Tetr)].

 

 

(fuente: internet, solo referencia)