Células CAR-T para el tratamiento del cáncer: diseño actual y desarrollo futuro 

 

Células CAR-T para el tratamiento del cáncer: diseño actual y desarrollo futuro. La inmunoterapia ha ido creciendo en la última década como una terapia alternativa para el tratamiento del cáncer.

En este capítulo, estudiamos las células CAR-T, que son células T autólogas modificadas genéticamente que pueden expresar receptores quiméricos específicos para antígenos expresados ​​en la superficie de las células tumorales.

Aunque este tipo de terapia personalizada está revolucionando el tratamiento del cáncer, especialmente las neoplasias malignas de células B, todavía tiene algunas limitaciones desafiantes.

Aquí, discutimos los aspectos inmunológicos y técnicos básicos de la terapia con células CAR-T, las limitaciones que han comprometido su eficacia y seguridad, y las estrategias propuestas actualmente para superar estas limitaciones, de modo que las células CAR-T tengan un mayor valor de aplicación terapéutica.

 

 

1. Introducción

Los métodos convencionales de tratamiento del cáncer, como la quimioterapia y la radioterapia, son eficaces en muchos casos, pero aún tienen varias limitaciones: (a) no son específicos y, por tanto, afectan a dos tumores igual que a las células normales; (b) No pueden eliminar eficazmente las células tumorales en todos los pacientes; (c) debilitan la capacidad natural del cuerpo para defenderse de las células cancerosas, y (d) pueden causar una variedad de efectos secundarios que afectan a los pacientes tratados.

En la última década, la inmunoterapia se ha convertido en un método de tratamiento alternativo para muchos tipos de tumores, que puede usarse solo o en combinación con otros métodos de tratamiento convencionales o innovadores [1]. La inmunoterapia consiste en métodos técnicos que utilizan componentes solubles o celulares del sistema inmunológico para el tratamiento del cáncer y las enfermedades inmunomediadas [2]. La inmunoterapia celular adoptiva se caracteriza por el uso de subconjuntos de células del sistema inmunológico con fines terapéuticos [3].

En los últimos años, el desarrollo de tecnología de ingeniería genética y procesos biológicos basados ​​en células ha permitido la generación y expansión de células T antitumorales modificadas genéticamente, superando los obstáculos reales que antes limitaban el uso de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en programas de inmunoterapia. [4].

 

2. Diseño de COCHE

Las células CAR-T son células T que han sido diseñadas genéticamente para expresar receptores quiméricos que se dirigen a antígenos específicos. CAR (Receptor de antígeno quimérico) es una molécula quimérica de receptor de células T (TCR) fusionada con un dominio de reconocimiento de antígeno, como un fragmento monocatenario de un anticuerpo monoclonal (scFv) [5]. Por lo tanto, a pesar de tener TCR natural, las células CAR-T aún pueden reconocer antígenos específicos en la superficie de otras células a través de los receptores CAR. A diferencia del reconocimiento mediado por TCR, el reconocimiento del antígeno CAR no depende del complejo principal de histocompatibilidad (MHC).

Las moléculas CAR pueden unirse a antígenos reconocidos por sus regiones scFv en la superficie de las células tumorales. Los antígenos pueden ser proteínas, carbohidratos o lípidos, porque los anticuerpos / scFv pueden unirse a tales moléculas. Para todas las terapias dirigidas contra el cáncer, el objetivo debe ser específico de las células cancerosas para evitar daños en las células y tejidos sanos.

Los tumores de células B se consideran candidatos a fármacos ideales para la terapia dirigida a células CAR-T. Las células B pueden ser fácilmente dirigidas por marcadores específicos y selectivos (como CD19). Además, el CD19 no está presente en la mayoría de los tejidos normales (excepto en las células B normales), lo que lo convierte en un objetivo / antígeno relativamente seguro [5].

Actualmente, los CAR se dividen en tres generaciones de acuerdo con sus dominios de transducción de señales intracelulares. La primera generación consta únicamente del dominio extracelular (scFv) y el dominio CD3ζ intracelular (Figura 1a). El CAR de segunda generación tiene un dominio coestimulador molecular CD28 o 4-1BB único, que mejora la eficacia clínica del tratamiento al aumentar la tasa de supervivencia de los linfocitos T modificados (Figura 1b) [5,6]. El CAR de tercera generación contiene moléculas con tres o más dominios coestimuladores citoplasmáticos. Además de CD28 y 4-1BB, también se pueden acoplar CD27, ICOS u OX40, mejorando teóricamente la activación, supervivencia y eficacia de los linfocitos T modificados genéticamente (Figura 1c). Sin embargo, hasta ahora, el CAR de segunda generación ha mostrado los mejores resultados clínicos y seguridad [7, 8].

3. Activación de linfocitos y transducción CAR

La producción de células CAR-T comienza con la recolección de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de los pacientes a través de muestras de sangre o recolección de sangre venosa periférica. Inicialmente, el no fraccionado se ha utilizado como materia prima para que sus células CAR-T produzcan células T. Dado que la composición de PBMC puede variar mucho, esta técnica puede producir productos de células CAR-T inconsistentes.

Las perlas inmunomagnéticas se pueden usar para separar subpoblaciones de células T, eliminando así los monocitos, inhibiendo así la activación y expansión de las células T [9, 10], produciendo así productos de células CAR-T ricos en células T (CD3 total, CD3 + CD4 + o CD3 + CD8). Sin embargo, la relación CD4: CD8 varía mucho entre pacientes. El número y la frecuencia de los subgrupos de CD4 y CD8 que reciben varios tratamientos de quimioterapia para el cáncer varían enormemente. En comparación con las personas sanas, hay más células T CD8 que CD4. Esto puede afectar a la preparación de productos de células CAR-T con actividad antitumoral [11].

Las funciones de las células T CD4 y CD8, su capacidad para proliferar y persistir en el cuerpo y su proporción en sangre periférica (proporción CD4: CD8) son diferentes. Además, los subgrupos CD4 y CD8 (natural, células madre de memoria, memoria central, efectores y reguladores) difieren en sus marcadores extracelulares e intracelulares y en sus vías de señalización metabólicas y epigenéticas [12,13]. En este caso, los subconjuntos CD4 y CD8 pueden separarse durante la preparación de productos de células CAR-T, y pueden agregarse en una proporción determinada al final de la expansión.

En un futuro próximo, como parte del proceso biológico de producción de la terapia con células CAR-T, se pueden aislar subconjuntos de células T específicos antes de la activación / transducción o después de la expansión para regular la composición celular de los productos de las células CAR-T. Por supuesto, el control de la composición celular de los productos de células CAR-T reducirá su variabilidad y mejorará su proliferación, persistencia y eficacia in vivo.

 

 

4. Las limitaciones de la terapia CAR-T autóloga actual y la próxima dirección de desarrollo

Aunque la terapia con células CAR-T ha tenido éxito clínico en los últimos años, este método de tratamiento todavía tiene muchas limitaciones conceptuales inherentes.

El CAR convencional que se utiliza actualmente tiene una especificidad de un solo objetivo y, debido a la heterogeneidad de la mayoría de los tumores, puede conducir al escape del tumor [17,18]. Otra limitación de la terapia actual es que el diseño CAR tradicional no puede controlar directamente la reactividad de las células CAR-T. Después de la infusión, las células CAR-T pueden expandirse hasta 10.000 veces en respuesta a sus antígenos, lo que hace que el grado de respuesta sea impredecible, lo que puede causar efectos secundarios graves [19]. En ensayos clínicos recientes, aproximadamente un tercio de los pacientes experimentaron fiebre e inflamación severas, y todos los pacientes habían desarrollado hipoplasia crónica de células B. La hipoplasia de células B puede aliviarse mediante la administración de gammaglobulina.

Entre los efectos secundarios, el más grave es el "síndrome de liberación de citocinas" (SRC) que es potencialmente mortal. En pacientes con mayor carga tumoral, el SRC parece agravarse y a menudo se acompaña de síndrome de activación de macrófagos (es decir, activación incontrolada y proliferación de macrófagos) y síndrome de lisis tumoral (es decir, material intracelular repentino después de la lisis tumoral) liberado al torrente sanguíneo). Afortunadamente, los efectos del SRC se pueden reducir reduciendo el número de células T inyectadas y / o administrando anticuerpos monoclonales anti-receptor de IL-6 (Tocilizumab, Actemra®) y esteroides [20].

Actualmente se están discutiendo algunas estrategias para mejorar la eficacia y seguridad de las terapias CAR-T actuales (Figura 2).

4.1 Transducción CAR de células T alogénicas

La terapia con células CAR-T autólogas actual está dirigida a pacientes. Por lo tanto, requieren un trabajo intensivo en mano de obra y un largo tiempo de producción (generalmente de 3 a 4 semanas para producir productos de células CAR-T). Aunque no lleva mucho tiempo considerar el tratamiento personalizado, es mucho más largo que muchos tratamientos contra el cáncer no personalizados, que los pacientes pueden utilizar casi de inmediato.

Debido al bajo recuento de linfocitos y las células invadidas presentes en los pacientes con cáncer, la expansión y producción de células T auto-modificadas no es una tarea fácil. Debido a un fallo de producción, aproximadamente el 9% de los pacientes que reciben el tratamiento piloto con Kymriah (tisagenlecleucel) no pueden obtener el producto [21]. Por lo tanto, las células T alogénicas modificadas genéticamente listas para usar obtenidas de donantes sanos son atractivas de muchas maneras.

Las células alogénicas del donante y del receptor pueden tener incompatibilidad en el complejo del antígeno leucocitario humano (HLA), lo que da lugar a una enfermedad de injerto contra huésped (EICH) grave [22]. Por otro lado, el rechazo puede conducir a la eliminación de las células CAR-T, lo que conduce al fracaso del tratamiento. Para resolver este problema, se desarrollaron células CAR-T alogénicas HLA (UCART19) para prevenir reacciones alogénicas [23]. Los primeros resultados del estudio clínico UCART mostraron que 4 de los 6 pacientes que recibieron la dosis inicial del tratamiento recayeron 4-6 meses después del tratamiento, y 1 de ellos tenía EICH cutánea, lo que indicó que las moléculas HLA son parte de las células CAR-T. . La expresión es alérgica [24]].

Para resolver estos problemas, la investigación avanza hacia la próxima generación de terapias CAR-T, que son terapias alogénicas o terapias "listas para usar", que pueden producirse en masa a partir de células de donantes sanos y usarse en múltiples pacientes. Para los productos alogénicos, aún deben responderse muchas preguntas, como si las células T de un donante se pueden expandir por completo, o si un donante debe hacer varias donaciones, y si se obtendrán CAR comparables de diferentes donantes. ¿Es mejor usar lotes? de productos de células T, o utilizar una gran cantidad de grupos de linfocitos de donantes para la producción a gran escala? Por supuesto, para diferentes donantes, la variabilidad individual a nivel celular suele ser alta, pero las células recolectadas del mismo donante en diferentes momentos también muestran un cierto grado de variabilidad.

4.2 Manejo de la toxicidad terapéutica de las células CAR-T

En algunos casos, las células CAR-T pueden expandirse incontrolablemente en el cuerpo, lo que puede estar relacionado con una toxicidad potencialmente mortal y una displasia crónica de células B. Por tanto, existe la necesidad de controlar la proliferación de células T modificadas genéticamente en los pacientes. Para hacer frente a este desafío, se ha desarrollado un CAR conmutable (sCAR) [30, 31]. Las células sCAR-T pueden controlar la actividad de las células CAR-T en dosis titulables mediante el uso de anticuerpos o interruptores basados ​​en moléculas pequeñas. Otra ventaja de este sistema es que puede cambiar a diferentes objetivos. Además, se han desarrollado CAR con genes suicidas para evitar la amplificación incontrolada in vivo [32].

Por otro lado, el microambiente tumoral inmunosupresor puede tener un impacto negativo en la expansión y actividad de las células CAR-T en el cuerpo. Una estrategia para superar esta limitación es co-modificar las células CAR-T con citocinas proinflamatorias como la interleucina 12 (IL-12) y la interleucina 18 (IL-18). La IL-12 es una citoquina proinflamatoria producida por las CD y los macrófagos, y se ha demostrado que promueve la maduración de las CD y aumenta la proliferación de las células T [33].

4.4 Desarrollo de células CAR-T que reconocen múltiples antígenos

El CAR convencional actualmente en uso tiene una especificidad de un solo objetivo. Debido a la heterogeneidad de la mayoría de los tumores, este método puede conducir al escape del tumor. Se ha diseñado un nuevo diseño de CAR, CAR en tándem, para expresar dos dominios de unión a antígeno más específicos y más seguros. Las células T CAR en tándem solo se activan cuando reconocen dos antígenos diferentes al mismo tiempo. Hegede y col. [34] desarrolló un CAR en tándem con el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico antihumano (HER2) y la unión mutante de IL-13 al receptor de IL-13 α2 (IL-13Rα2), en el que CD28 actúa como moléculas coestimuladoras, y cadena CD3ζ como el dominio de transducción de señales. Por lo tanto, puede unirse a HER2 o IL-13Rα2 para reducir el escape de antígenos tumorales [34].

Recientemente, científicos de la Universidad de Boston y el Instituto de Tecnología de Massachusetts (MIT) desarrollaron una nueva tecnología CAR llamada CAR “Split, Universal y Programable” (SUPRA), que aborda simultáneamente la resistencia tumoral y el sistema inmunológico El problema de la sobreactivación y la especificidad [ 35]. Los SUPRA-CAR se componen de dos partes: una es un receptor universal expresado en células T, llamado zipCAR, y la otra es un adaptador scFv dirigido a tumores, llamado zipFv. El receptor universal zipCAR se produce mediante la fusión del dominio de señalización intracelular y la cremallera de leucina como dominio extracelular. La molécula adaptadora zipFv se produce mediante la fusión de una cremallera de leucina apropiada y scFv. El scFv de zipFv se une a los antígenos tumorales y la cremallera de leucina se une y activa zipCAR en las células T [35]. Este SUPRA-CAR tiene características únicas que pueden ajustar múltiples variables, por ejemplo, (1) afinidad entre dos pares, (2) afinidad entre el antígeno tumoral y scFv, (3) concentración de zipFv y (4) zipCAR El nivel de expresión puede utilizarse para regular la respuesta de las células T. Los experimentos in vitro muestran que SUPRA-CAR tiene el potencial de aumentar la especificidad tumoral y reducir la toxicidad. Las pruebas preclínicas in vivo han demostrado que SUPRA-CAR puede reducir la carga tumoral en modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer de mama y modelos de tumores hematológicos [35]. Además, los estudios in vivo han confirmado que se pueden utilizar una variedad de métodos para controlar el sistema SUPRA-CAR, como CRS, para regular con precisión el sistema SUPRA-CAR [35]. (3) concentración de zipFv y (4) zipCAR El nivel de expresión puede usarse para regular la respuesta de las células T. Los experimentos in vitro muestran que SUPRA-CAR tiene el potencial de aumentar la especificidad tumoral y reducir la toxicidad. Las pruebas preclínicas in vivo han demostrado que SUPRA-CAR puede reducir la carga tumoral en modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer de mama y modelos de tumores hematológicos [35]. Además, los estudios in vivo han confirmado que se pueden utilizar una variedad de métodos para controlar el sistema SUPRA-CAR, como CRS, para regular con precisión el sistema SUPRA-CAR [35]. (3) concentración de zipFv y (4) zipCAR El nivel de expresión puede usarse para regular la respuesta de las células T. Los experimentos in vitro muestran que SUPRA-CAR tiene el potencial de aumentar la especificidad tumoral y reducir la toxicidad. Las pruebas preclínicas in vivo han demostrado que SUPRA-CAR puede reducir la carga tumoral en modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer de mama y modelos de tumores hematológicos [35]. Además, los estudios in vivo han confirmado que se pueden utilizar una variedad de métodos para controlar el sistema SUPRA-CAR, como CRS, para regular con precisión el sistema SUPRA-CAR [35]. Las pruebas preclínicas in vivo han demostrado que SUPRA-CAR puede reducir la carga tumoral en modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer de mama y modelos de tumores hematológicos [35]. Además, los estudios in vivo han confirmado que se pueden utilizar una variedad de métodos para controlar el sistema SUPRA-CAR, como CRS, para regular con precisión el sistema SUPRA-CAR [35]. Las pruebas preclínicas in vivo han demostrado que SUPRA-CAR puede reducir la carga tumoral en modelos de ratón de xenoinjerto de cáncer de mama y modelos de tumores hematológicos [35]. Además, los estudios in vivo han confirmado que se pueden utilizar una variedad de métodos para controlar el sistema SUPRA-CAR, como CRS, para regular con precisión el sistema SUPRA-CAR [35].

 

Fig. Diseño y características del sistema SUPRA CAR (A) Comparación entre el diseño CAR convencional y SUPRA CAR. El sistema SUPRA CAR consta de zipCAR y zipFv. zipCAR tiene una cremallera de leucina debido a la parte extracelular de CAR, mientras que zipFv tiene scFv fusionado a una cremallera de leucina asociada, y scFv puede unirse a la cremallera de leucina en zipCAR. (B) El sistema SUPRA CAR que usa diferentes zipFv para atacar múltiples antígenos tumorales. Se cocultivaron in vitro células K562 que expresan Her2, mesotelina o Axl y células T primarias humanas CD8 + que expresan RR zipCAR (n = 3, media ± DE). (C) Variables exploradas para caracterizar el sistema SUPRA CAR: (1) Afinidad entre pares de cremalleras de leucina; (2) Afinidad entre el antígeno tumoral y scFv; (3) Concentración de zipFv; (4) ZipCAR de nivel de expresión SVF. (D) El efecto de la concentración de cremalleras de leucina (SYN 3, SYN5 y EE) con diferentes afinidades entre tres zipFv y RR zipCAR sobre IFN g producido por células T CD4 + primarias (n = 3, media ± DE). (E) El efecto de la afinidad de la cremallera, la afinidad del tumor scFv y el nivel de expresión de zipCAR sobre la producción de IFN-g por las células T CD4 + primarias que expresan RR zipCAR (n = 3, promedio).

4.5 Mejorar la actividad de las células CAR-T en el microambiente inmunosupresor

Normalmente, las células CAR-T no pueden migrar y / o penetrar en el sitio del tumor. Se ha demostrado que la incorporación de receptores de quimiocinas en moléculas CAR mejora el transporte de células CAR-T a tumores sólidos [36].

Otra estrategia para aumentar la infiltración de células CAR-T en tumores estromales estromales es incorporar heparanasa en moléculas CAR, que producirán y degradarán los componentes de la matriz extracelular de los tejidos tumorales in situ [37].

 

 

5. Conclusión

Las células CAR-T son una terapia revolucionaria para pacientes con cáncer. Hasta ahora, se han obtenido resultados clínicos satisfactorios para las neoplasias malignas de células B. Sin embargo, para el tratamiento de tumores sólidos, las células CAR-T no son tan efectivas. Por lo tanto, todavía se necesitan muchas mejoras. Como se describe en este capítulo, varios métodos prometedores están mejorando la eficacia terapéutica y la seguridad de las células CAR-T.

En la actualidad, la mayor actividad antitumoral de las células CAR-T coincide con los mayores efectos secundarios. Por lo tanto, recientemente se han propuesto varias medidas de adaptación de la seguridad, como los CAR modificados genéticamente suicidas o los CAR divididos (como SUPRA-CAR).

Además, la persistencia de las células CAR-T in vivo necesita otras optimizaciones para proporcionar una protección más duradera contra la recurrencia del tumor. El desarrollo de células CAR-T alogénicas y los nuevos ajustes de diseño de las moléculas CAR promoverán el desarrollo de esta terapia. La terapia sinérgica con otras inmunoterapias convencionales (como los inhibidores de puntos de control inmunitarios) puede ampliar la aplicación clínica de las células CAR-T en un futuro próximo.

 

 

(fuente: internet, solo referencia)