Células tumorales circulantes y tecnología de detección de ADN tumoral circulante

Células tumorales circulantes y tecnología de detección de ADN tumoral circulante. Los tumores malignos son la enfermedad más importante que amenaza la salud humana, y la detección temprana de tumores es la forma más eficaz de combatirlos.

Los estudios han encontrado que las células tumorales o los fragmentos de ADN del tumor se liberan en los fluidos corporales en las primeras etapas de la aparición del tumor. Por lo tanto, la detección de células tumorales circulantes (CTC) y ADN tumoral circulante (ADNct) en los fluidos corporales es útil para el diagnóstico temprano de tumores.

Las CTC fueron propuestas por primera vez por Nowell [1] y definidas por Nowell como células tumorales que se originan en tumores primarios o tumores metastásicos, adquieren la capacidad de separarse de la membrana basal y entrar en los vasos sanguíneos a través de la matriz tisular invasora. Son tumores primarios y tumores metastásicos.

El puente entre ellos juega un papel importante en el diagnóstico de tumores, la evaluación del efecto del tratamiento y la monitorización de la recurrencia y la metástasis [2]. El ctDNA es un fragmento de gen episómico liberado por las células tumorales, que tiene entre 20 y 200 pb de longitud y tiene las características de las mutaciones genéticas de las células tumorales.

Las diversas tecnologías de detección de CTC y ctDNA se han desarrollado rápidamente. Por sus ventajas de no invasividad, muestreo múltiple, alta especificidad, ciclo metabólico corto, etc., pueden reflejar cambios tumorales en tiempo real y se utilizan gradualmente en el campo médico, pero existen en aplicaciones clínicas. El problema requiere un análisis cuidadoso.

 

 

El desarrollo de la tecnología de detección de CTC

La cantidad de CTC en la circulación sanguínea es muy pequeña y las células sanguíneas interfieren fácilmente en la detección. Por lo tanto, es necesario enriquecer las CTC antes de la detección para obtener CTC de mayor pureza. Actualmente existen dos métodos principales de enriquecimiento: tecnología de enriquecimiento basada en inmunología y biofísica; Los métodos de detección de CTC tienen hasta 40 tipos, que incluyen principalmente el método de recuento de CTC, el método de inmunofluorescencia, el método de detección de genes, etc. 

 

(1) Tecnología de enriquecimiento de CTC

1. Tecnología de enriquecimiento basada en inmunología:

La tecnología inmunológica es principalmente el método de enriquecimiento de perlas inmunomagnéticas, que se divide en método de enriquecimiento positivo y método de enriquecimiento negativo [3]. El método de enriquecimiento positivo consiste en aislar directamente las células diana de la mezcla de células. Es principalmente adecuado para tumores de células epiteliales (cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de pulmón, etc.). El método más representativo es el método de detección de CTC de CellSearch. Criterios: Marcadores característicos de células EpCAM + / CK + / CD45- de CTC, la relación entre el número de CTC y el pronóstico del paciente, etc. El método de enriquecimiento negativo utiliza perlas magnéticas para unirse a las células de fondo (como los glóbulos blancos), y luego utiliza anticuerpos anti-CD45 o anti-CD61 para eliminar las células polimerizadas y las plaquetas en la sangre para obtener las células diana CTC [4]. El método de enriquecimiento negativo es más adecuado para la investigación. Muestras sin marcadores selectivos o de difícil eliminación de determinados conjugados.

2. Tecnología de detección basada en biofísica:

La tecnología de detección basada en características biofísicas utiliza principalmente el volumen de células CTC, la densidad, la deformabilidad, las características de electroforesis y otras características biofísicas para distinguir las células CTC de otras células como los leucocitos. No necesita depender de biomarcadores y supera las perlas magnéticas inmunes. Algunas fallas de la ley [5].

Método de separación basado en el volumen celular: en términos generales, el volumen celular de las CTC es mayor que el de los glóbulos blancos [6] y el citoplasma es el doble que el de los glóbulos blancos [7]. La heterogeneidad del volumen de CTC puede deberse a la apoptosis celular o células en diferentes ciclos metabólicos celulares, que pueden usarse para aislar CTC e identificar o estadificar tumores mediante detección.

Método de separación basado en la variabilidad celular: la variabilidad de las células CTC es mayor que la de las células no tumorales y sus características favorecen la separación. El método de centrifugación en gradiente de densidad comúnmente utilizado se basa en la densidad y variabilidad de los glóbulos rojos, glóbulos blancos y células tumorales, y las células correspondientes se obtienen por centrifugación. La centrifugación en gradiente de densidad se utiliza generalmente como método preliminar para la separación de CTC.

Basado en la tecnología de separación por membrana de microfiltración: el principio del método de membrana de microfiltración se basa en el gran volumen celular de CTC y la alta dureza de la membrana celular. Este método fue utilizado por primera vez por Seal para la separación de CTC [8], y sus tecnologías representativas son ISET® (Rarecells Diagnostics) y ScreenCell® (ScreenCell). ISET® se utiliza ampliamente en la investigación clínica, principalmente para metástasis de células tumorales, cáncer de pulmón de células no pequeñas, etc. [9]. ScreenCell® se utiliza principalmente para la investigación de mecanismos celulares, cultivos celulares y pruebas moleculares celulares. Con el microfiltro CellSieve ™, se puede encontrar un promedio de 56 CTC en la sangre de cada paciente con tumor metastásico (10 ml) [10], e incluso se encuentran macrófagos relacionados con el tumor [11].

3. Método de cultivo de CTC:

El método de cultivo puede aislar y cultivar CTC con características tumorales de tumores malignos como cáncer de pulmón, cáncer de cuello uterino, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer de mama, etc. [12], y luego realizar una prueba celular. Los resultados tienen una gran especificidad, pero el cultivo lleva mucho tiempo. (14 ~ 28 días), no es propicio para un gran número de desarrollo clínico.

 

(2) Método de detección de CTC

1. Método de recuento de CTC:

El método de recuento de CTC es un método de detección básico que utiliza marcadores moleculares específicos en la superficie de la membrana celular para separar y contar, y los resultados pueden mostrar el pronóstico [13].

2. Método de detección de etiquetado por inmunofluorescencia de CTC:

El método de detección de marcado por inmunofluorescencia utiliza principalmente diferentes marcadores fluorescentes para marcar diferentes células. El método de detección más utilizado es el sistema CellSeach® [14], que es un estándar general para la detección de CTC. El microscopio de fluorescencia automático se utiliza para detectar el recuento de CK + / DAPI + / CD45-. Este método tiene una alta especificidad y es fácil de estandarizar, pero debido a la falta de antígeno específico, es fácil causar falsos negativos.

3. Método de prueba genética:

Incluyendo PCR cuantitativa de fluorescencia, tecnología de chip de genes de CTC, secuenciación de genes de CTC y detección de tecnología de microfluidos.

PCR cuantitativa de fluorescencia: la PCR cuantitativa de fluorescencia consiste en lisar primero las CTC enriquecidas y utilizar técnicas relacionadas con la PCR para detectar ARN libre en la sangre para confirmar las CTC. Se puede detectar una CTC en (1-10) × 106 células normales, pero es fácil que aparezcan productos de ARN inespecíficos que provocan falsos positivos. La PCR de transcripción inversa es más específica que la PCR. Puede detectar niveles de ARN específicos de tumores y tiene una alta sensibilidad. Sin embargo, la PCR con transcripción inversa es propensa a la contaminación de la muestra y algunas reacciones inflamatorias también pueden secretar CTC, lo que da lugar a resultados falsos positivos. La PCR fluorescente cuantitativa en tiempo real y la PCR cuantitativa con sonda en tiempo real son nuevos métodos que han surgido en los últimos años. Se pueden utilizar sondas específicas y detección cuantitativa en tiempo real para detectar conjuntamente CTC,

Tecnología de chip de genes CTC: la tecnología de detección desarrollada según el principio de la tecnología de control de microfluidos se basa principalmente en el principio de fluidos combinados con la reacción antígeno-anticuerpo para capturar CTC en la muestra. Esta tecnología ha detectado con éxito una gran cantidad de CTC en la sangre periférica de pacientes con cáncer de pulmón, cáncer de páncreas y cáncer de colon; después de 2010, se ha desarrollado una tecnología de chips de segunda generación que puede teñirse en un chip y caracterizarse por una matriz similar a una espina de pescado [15], que acorta el tiempo de reacción antígeno-anticuerpo y aumenta considerablemente la tasa de detección de CTC, pero la La aplicación de la tecnología de chips genéticos en la aplicación clínica aún necesita más práctica y verificación.

Secuenciación de genes de CTC: la información secuenciada puede contener información de mutación que no se encuentra en el tumor primario. La comparación de los cambios genéticos entre el tumor primario y las CTC también puede ayudar a descubrir la relación entre las mutaciones genéticas y la progresión y el tratamiento de la enfermedad. Es un tumor maligno. Para brindar ayuda.

Detección de tecnología de microfluidos: es una tecnología que utiliza chips de microfluidos para controlar pequeños fluidos a niveles de micrones y submicrones. Puede simular la interacción de las células y tiene las ventajas de no contacto, alta precisión, cultivo de tejidos, suministro de nutrientes y eliminación de desechos. Además de un alto rendimiento, un volumen de reacción pequeño y un tamaño de muestra pequeño, tiene las características de análisis en paralelo de varios elementos en una pequeña cantidad de muestra, de modo que los procesos de reacción, pretratamiento y detección del experimento se integran en un sistema de microfluidos. Completado, tiene un gran potencial de desarrollo y valor de aplicación [16,17]. Sin embargo, debido a que los productos de microfluidos generalmente no se utilizan en los laboratorios clínicos, aún se carece de su control de calidad, repetibilidad, linealidad y precisión.

 

 

Desarrollo de tecnología de detección de ctDNA

En 1989, un estudio encontró que parte del ADN libre en el plasma de pacientes con tumores provenía de células tumorales [18]. El contenido de ctDNA en sangre periférica es muy pequeño, los fragmentos son pequeños y es fácil de combinar con proteínas plasmáticas. La calidad y cantidad de ADN aislado de diferentes tumores varía mucho. En los últimos años, se han aplicado cada vez más tecnologías de alta sensibilidad y alta especificidad a la detección de ctDNA, lo que hace que el ctDNA sea ampliamente utilizado en la investigación relacionada con tumores. En la actualidad, existen muchos tipos de tecnologías de detección de ctDNA, que incluyen principalmente la tecnología de PCR y las tecnologías de detección basadas en secuenciación de próxima generación (NGS). 

 

(1) tecnología de detección de ctDNA basada en PCR

1. Tecnología de PCR digital:

La PCR digital realiza una "amplificación por PCR de plantilla de una sola molécula" y utiliza un reactor positivo para determinar el número de copias del ADNc de la célula diana. La PCR digital de gotitas puede incluso detectar el límite inferior de detección del 0,001% [19]. La desventaja de este método de detección es que no puede detectar mutaciones desconocidas y no es adecuado para la detección de muestras de ADN de alta concentración. Por lo tanto, la tecnología de PCR digital actual se utiliza principalmente en la investigación científica y no se ha utilizado ampliamente en la práctica clínica.

2. Tecnología BEAMing:

La tecnología BEAMing es una combinación de PCR digital y citometría de flujo, que utiliza cebadores de PCR específicos para combinar con las perlas magnéticas correspondientes y amplificar, y luego usar citometría de flujo para detectar etiquetas fluorescentes para determinar mutaciones, como pueden detectarse pacientes con cáncer de mama Fosfatidilinositol 3- mutación de la subunidad α catalítica de quinasa, mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico en cáncer de pulmón de células no pequeñas, etc. Este método de detección es muy sensible, pero actualmente es difícil detectar mutaciones en tumores más pequeños, ni puede utilizarse para descubrir nuevas mutaciones [ 20,21].

 

(2) Tecnología de detección de ctDNA basada en NGS

1. Secuenciación profunda amplificada por marcador:

La secuenciación profunda amplificada por etiquetas tiene un alto rendimiento y un tiempo de secuenciación corto, que puede detectar de cientos de miles a millones de moléculas de ADN a la vez. El principio principal es diseñar cebadores para la región objetivo durante 15 ciclos de preamplificación, luego amplificar selectivamente la región del amplicón con mutaciones mediante PCR de un solo plexo y, finalmente, agregar adaptadores de secuenciación y etiquetas específicas en ambos extremos del amplicón. secuenciado de un solo extremo. Esta tecnología puede detectar mutaciones genéticas en pacientes con cáncer y también favorece la orientación de la medicina personalizada. En comparación con la secuenciación del genoma completo, es más económica y eficaz, pero hay ciertos falsos positivos.

2. Método de análisis personalizado de secuenciación profunda de tumores:

El método de secuenciación profunda del análisis de tumores individualizado es una tecnología de secuenciación de captura que utiliza fuentes como bases de datos de mutaciones de genes tumorales para encontrar la secuencia correspondiente a la célula diana, y luego realiza una captura dirigida de la muestra antes de realizar pruebas en profundidad. Esta tecnología se utiliza principalmente para detectar el ctDNA del carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). La sensibilidad del ctDNA en NSCLC por encima del estadio II es del 100% y la sensibilidad del estadio I es del 50%. La especificidad es del 96% [22].

3. Tecnología de secuenciación de códigos de barras:

La tecnología de secuenciación de códigos de barras tiene alta fidelidad, principalmente a través de la conexión aptámero para aumentar la secuencia del código de barras, para realizar una secuenciación profunda, y luego usar la amplificación lineal para eliminar errores en la PCR, que se puede usar para identificar moléculas individuales. Esta tecnología reduce la probabilidad de errores en la amplificación por PCR, pero el rendimiento de la detección es bajo y solo se puede estudiar un factor de nucleosoma a la vez. Se necesita más investigación para mejorar su rendimiento de detección para que sea ampliamente utilizado en la práctica clínica.

4. Tecnología de secuenciación del exoma completo:

La secuenciación del exoma completo (WES) es un método de análisis de secuenciación de alto rendimiento que utiliza tecnología de captura de secuencias para capturar y enriquecer el ADN de la región del exón de todo el genoma. La secuenciación del exoma tiene ventajas obvias sobre otras tecnologías de secuenciación en términos de rango de cribado y tasa de detección. En comparación con la resecuenciación del genoma, el costo es menor. También tiene mayores ventajas para estudiar SNP e Indels de genes conocidos, como la comparación de la biopsia de tejido de neuroblastoma, mutaciones somáticas de ctDNA y cambios en el número de copias de genes, para explorar la heterogeneidad tumoral del neuroblastoma [23]. Su desventaja es que solo puede obtener la información de la variación dentro o en el límite de la región del exón, y no puede detectar la gran variación estructural en el genoma.

5. Secuenciación dirigida:

La secuenciación dirigida, también conocida como secuenciación de la región diana, es el uso de PCR o hibridación de sonda para capturar y enriquecer la región genómica diana, realizar una secuenciación de alto rendimiento, detectar sitios de mutación genética y obtener información de mutación en la región diana designada. En comparación con la secuenciación tradicional de primera generación, la secuenciación del genoma completo y la secuenciación del exoma completo, la secuenciación del área objetivo puede obtener una cobertura más profunda y una mayor precisión de los datos, y mejorar la eficiencia de detección del área objetivo.

 

 

Conclusión y perspectiva

En comparación con las técnicas tradicionales de obtención de imágenes o biopsia de tejido, las CTC y el ctDNA tienen ventajas significativas. La fuente de la muestra puede ser sangre u otros fluidos corporales y se puede realizar una detección no invasiva. Al mismo tiempo, encontrar CTC o ctDNA en la sangre o los fluidos corporales tiene una evidencia más directa para el diagnóstico de tumores y puede usarse para guiar el tratamiento y la evaluación del pronóstico. Sin embargo, la detección de CTC o ctDNA tiene ciertas limitaciones, y su contenido en sangre o fluidos corporales es muy bajo, especialmente ctDNA. En segundo lugar, debido a la heterogeneidad de las células tumorales, los requisitos técnicos para CTC y ctDNA son muy altos. Cómo extraer CTC y ctDNA de alta pureza también es un desafío para la aplicación clínica de estos dos métodos. Además, no todos los tumores tendrán CTC o ctDNA en la circulación sanguínea u otros fluidos corporales,

Cuando se utilizan CTC y ctDNA en el diagnóstico y el tratamiento clínicos, se debe prestar atención a los siguientes aspectos:

(1) Estandarización de los procedimientos de procesamiento de muestras antes de la prueba. Los diferentes métodos de detección utilizan diferentes tipos de agentes citoprotectores, y el tiempo de almacenamiento después de la recolección, el proceso de centrifugación y la extracción y purificación del ctDNA son diferentes, y estas diferencias pueden afectar los resultados.

(2) Estandarización de los procedimientos de prueba. Los diferentes métodos o plataformas de detección tienen diferentes volúmenes de muestra, rendimiento de detección y objetivos de detección para CTC y ctDNA, y los procedimientos operativos también son muy diferentes, lo que da como resultado una baja comparabilidad de los resultados entre diferentes empresas, por lo que se requieren procedimientos de detección estandarizados. Haga que los resultados de la prueba sean comparables.

(3) El gobierno mejora las políticas y los mecanismos regulatorios pertinentes. En la actualidad, la aplicación clínica de CTC y ctDNA está sujeta a ciertas restricciones. Además de la alta tecnología de prueba y los requisitos de la plataforma, sus precios también están atrayendo la atención.

La sensibilidad y especificidad de los diferentes métodos o plataformas son muy diferentes, y el rendimiento del diagnóstico clínico también es diferente, lo que provoca ciertas dificultades en la comparabilidad y repetibilidad de los resultados. Cómo elegir un método que sea más adecuado para su propia investigación o factible de laboratorio entre los complicados métodos de detección también es un problema que los trabajadores médicos deben considerar.

Además de dominar los diversos principios, ventajas y desventajas de las tecnologías de detección existentes en la actualidad, el método para resolver el cuello de botella de la tecnología de detección es más importante para estimular más ideas de investigación a través de la comparación metodológica y para mejorar aún más o perfeccionar las tecnologías de detección relacionadas. Las CTC y el ctDNA se han utilizado ampliamente en la práctica clínica.

 

 

 

 

 

 

(fuente: internet, solo referencia)