Evaluación de farmacia IND / NDA para la aplicación de productos de terapia génica

 

Evaluación de farmacia IND / NDA para la aplicación de productos de terapia génica. En comparación con otros vectores virales, los vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) tienen las ventajas de una fuerte capacidad de infección, expresión sostenible de genes diana, no patogenicidad e integración no genómica, etc., y se han convertido en el principal vector viral para genes. terapia in vivo.

Este artículo resume los últimos avances de la investigación de los productos de terapia génica rAAV y analiza los puntos clave de la evaluación farmacéutica de dichos productos desde los aspectos de materias primas, tecnología de producción y control de calidad, con el fin de promover la transformación clínica y la aplicación de dichos productos. Al mismo tiempo, se discuten los puntos de consideración de la evaluación de la farmacia y los problemas comunes de 3 productos comercializados en el extranjero.

 

El estado de desarrollo de la industria de la terapia génica rAAV

Según estadísticas incompletas, al menos 238 productos de terapia génica rAAV se encuentran actualmente en ensayos clínicos y se han registrado 3 productos de terapia génica rAAV en Europa y Estados Unidos (Tabla 1).

Tabla 1 Aplicación clínica de productos de terapia génica rAAV

 

 

1. Contenido de la investigación y evaluación de materias primas

1.1. Diseño molecular de virus

El diseño del vector de rAAV debe basarse en la eficacia clínica y la seguridad, dirigiéndose generalmente a tejidos o células específicos, eliminando genes relacionados con la virulencia, patogenicidad o capacidad de replicación para garantizar la seguridad del producto. Al mismo tiempo, el diseño debe considerar el tamaño del genoma del vector, la eficiencia de empaquetamiento y la eficiencia de expresión, y minimizar la homología con virus relacionados en el cuerpo para evitar la formación de virus replicantes. Se debe considerar el riesgo de introducir genes de resistencia a los antibióticos al construir plásmidos de virus. Generalmente, no deben usarse genes de resistencia a ampicilina.

1.2, matriz de células de producción

En la actualidad, la matriz celular utilizada en la producción de rAAV en la industria incluye células de mamíferos (HEK293, BHK), líneas de células tumorales humanas (HeLa, A549) y líneas de células de insectos (SF9).

Las celdas de empaque deben estar completamente identificadas y se debe establecer un banco. Los elementos de identificación generalmente incluyen identificación, pureza, genotipo / fenotipo, tumorigenicidad / tumorigenicidad, estabilidad genética y secuencia introducida. Además de los hongos y micoplasmas estériles convencionales, se debe prestar especial atención a los virus específicos de la especie en la matriz celular. Por ejemplo: las células HEK293 deben analizarse para CMV, VIH-1/2, HILV-1/2, HH-V6 / 8, virus JV, virus BK, EBV, parvovirus B19, HBV, HPV y HCV y otros virus; Las células SF9 deben analizarse para detectar virus de insectos espirógenos como el cuerpo humano, rabdovirus.

Cuando se utilizan líneas de células tumorales humanas como células de empaquetamiento, también se debe evaluar completamente el riesgo de tumorigenicidad y tumorigenicidad, así como la infección de virus tumorigénicos, etc. Por ejemplo, las células HeLa son células tumorales derivadas de tejidos de cáncer de cuello uterino humano, que se sabe que contienen 50 copias del genoma del VPH-18 y la secuencia del gen E6 / 7 del virus. Por lo tanto, se recomienda verificar los residuos de genes de transferencia en el proyecto de control de calidad.

 

 

2. Investigación y evaluación del proceso de producción

2.1. Proceso upstream de productos AAV

2.1.1. Método de transferencia transitoria de plásmidos múltiples

El primer proceso de producción de rAAV utilizó plásmidos y virus auxiliares para infectar células de empaquetamiento. En la actualidad, se utiliza principalmente el proceso de producción de co-transfección de tres plásmidos HEK 293. Las células HEK293 contienen los genes E1a y E1b del adenovirus (AdV), cotransfectados con el plásmido de transferencia (que contiene el gen diana y la secuencia ITR) y el plásmido estructural (que contiene el gen rep / cap) y los plásmidos auxiliares (que replican los genes virales E2A , E4, VARNA, etc.), el rAAV se puede recombinar y empaquetar después de 48-72 h.

Este método es adecuado para una variedad de serotipos de rAAV, y el rendimiento de fermentación generalmente puede alcanzar 1014 VG por mililitro (genoma del vector), que generalmente puede alcanzar la cantidad de rAAV en los primeros ensayos clínicos (<1015 VG). Sin embargo, debido a las limitaciones de los métodos de cultivo adherentes, el proceso transitorio de plásmidos múltiples es difícil de satisfacer las necesidades de producción comercial (> 1016 VG).

2.1.2, método de celda de producción estable

Construya una línea celular HeLa transfectada estable que contenga el gen auxiliar rep / cap y el gen diana, y el virus rAAV también puede empaquetarse después de la infección por adenovirus. Especialmente utilizando la línea celular HeLa S3 que se puede cultivar en suspensión, el método de producción de células estables se puede escalar directamente hasta una escala de 2000 L. De manera similar, la construcción de células BHK que contienen el gen ICP27, después de la transfección con la replicación- d27.1HSV defectuoso que contiene el gen auxiliar y el gen diana, también puede expresar eficazmente rAAV.

Sin embargo, las principales desventajas del método de células estables son que la construcción celular y los estudios de estabilidad genética requieren mucho tiempo, y el uso de virus auxiliares en el proceso de producción plantea un riesgo para la seguridad del virus.

2.1.3 Método de infección por baculovirus de células de insectos

El baculovirus tiene un alto grado de especificidad de especie, no infecta a los vertebrados y puede transferir genes de rAAV y elementos de acción trans de función auxiliar a células de insecto SF9. Por ello, en los últimos años también se ha comenzado a utilizar en la producción masiva de rAAV. Las ventajas de este método son que el baculovirus tiene buena seguridad biológica, alta eficiencia de infección y el proceso de producción es fácil de escalar. Sin embargo, los baculovirus residuales y las sustancias relacionadas con el ADN también deben tenerse en cuenta en los proyectos de control de calidad.

Puntos clave de la evaluación de la farmacia:

Para el proceso de producción anterior de rAAV, la evaluación de la farmacia sugiere que se debe prestar atención al desarrollo del proceso y la verificación de los procesos clave. Por ejemplo, la transfección transitoria de múltiples plásmidos o la adición de virus auxiliares deben usarse para explicar el rango de control de los parámetros clave del proceso y la experiencia intermedia a través del desarrollo y la verificación del proceso. Estándares, como la proporción de diferentes vectores, la cantidad de reactivo de transfección, la multiplicidad de infección del virus auxiliar y la célula de producción, etc.

 

2.2 Proceso posterior de productos AAV

2.2.1, proceso de purificación

El proceso de purificación de rAAV generalmente incluye recolección de medios de cultivo celular, lisis de células por método químico / físico, digestión con enzima benzonasa para eliminar sustancias de ácido nucleico, cromatografía de múltiples pasos y centrifugación en gradiente de densidad, reemplazo de tampones de formulación de formulación y otros procesos. Entre ellos, la cromatografía de afinidad simula células. La unión del receptor captura rAAV. Por ejemplo, el relleno de sulfato de heparina puede unirse específicamente a rAAV2, y el relleno de agarosa AVB puede unirse a varios serotipos de rAVV como 1, 2, 3, 5 y 8 [22]. Para la eliminación de vehículos vacíos, actualmente se utilizan métodos de ultracentrifugación con iodixanol y cloruro de cesio.

Cabe señalar que la revisión general pertinente de la Farmacopea China establece claramente que "a menos que se demuestre lo contrario, el método de centrifugación por densidad de cloruro de cesio-bromuro de etidio no se utilizará para la purificación de productos de terapia génica".

2.2.2, verificación de eliminación de virus

Como se mencionó anteriormente, los baculovirus o virus auxiliares (HSV, Ad5, etc.) se usan cuando se usa un proceso de producción de células de insecto-baculovirus o línea celular de transfección estable (HeLa). Por lo tanto, los procesos posteriores deben agregar procedimientos específicos de eliminación / inactivación de virus.

Por ejemplo: usar el surfactante TritonX-100 (0.5%, v / v) y agregar un proceso de filtración de virus para eliminar el baculovirus residual en el líquido de recolección; el uso de tensioactivos, inactivación de pH bajo y otros procesos para eliminar el virus HSV; usando iones El método de intercambio, calentamiento de corta duración (52 ℃, 10 min) y nanofiltración se utilizan para eliminar el adenovirus.

2.2.3, prescripción de formulación

Debido a que la proteína de la cápside de rAAV no es sensible a los cambios de temperatura y pH, la formulación de los productos de rAAV es relativamente simple de desarrollar. Se usa comúnmente para agregar 200 mmol·L-1 de sulfato de magnesio o 0.001% de poloxámero F68 a la solución salina para evitar la formación de agregados, que básicamente pueden soportar el almacenamiento a largo plazo (-65 ℃) y la estabilidad del transporte.

Puntos de evaluación:

Para el proceso de producción posterior de rAAV, la evaluación de la farmacia recomienda combinar la eficiencia de eliminación de las impurezas relacionadas con el producto y las impurezas relacionadas con el proceso para evaluar la racionalidad y solidez del proceso de purificación. Para el proceso de producción que utiliza el virus auxiliar, la verificación del proceso de eliminación / inactivación del virus debe llevarse a cabo en combinación con el contenido de virus en el líquido de recolección, y la seguridad residual del virus debe evaluarse exhaustivamente.

 

 

 

3. Verificación de eliminación de virus

3.1. Impurezas relacionadas

3.1.1. Impurezas relacionadas con el proceso

Las impurezas relacionadas con el proceso de los productos rAAV incluyen la proteína del huésped, el ADN del huésped, el virus auxiliar, el plásmido, el suero y el cloruro de cesio introducidos en el proceso de empaquetado y purificación del virus. Dado que las células de empaquetamiento de virus generalmente contienen oncogenes, por ejemplo, las células HEK293 contienen genes de adenovirus E1A y las células HeLa contienen oncogenes E6 y E7. Por lo tanto, en general, el contenido de ADN residual de la célula huésped debe ser inferior a 10 ng / dosis y el fragmento de ADN residual debe ser inferior a 200 pb.

3.1.2. Impurezas relacionadas con el producto

Las impurezas relevantes en los productos rAAV incluyen virus vacíos con genes no empaquetados, virus con genes empaquetados incorrectamente (ADN del huésped, genes diana incompletos, genes de virus auxiliares, etc.), partículas de virus infecciosos, agregados o partículas de virus oxidadas, etc.

Estas impurezas relacionadas con el producto no solo no logran la expresión del gen diana en las células diana, sino que también pueden causar inmunogenicidad clínica o genotoxicidad. Por ejemplo, en un sistema de secuencia de plásmidos múltiples, la proporción de virus vacíos puede alcanzar del 50% al 98%. Los virus vacíos no son capaces de infectar y son fáciles de formar agregados de virus y degradarse, lo que provoca una respuesta inmune en el cuerpo. Por lo tanto, las técnicas A260 / A280, microscopía electrónica de transmisión, centrifugación analítica y espectrometría de masas deben utilizarse en la investigación de calidad para detectar el contenido de virus vacío.

El AAV competente para la replicación (rcAAV) se debe a las impurezas relacionadas con el producto producidas por los genes rep de empaquetamiento del virus rAAV y cap / AAP después de que se produzca la recombinación homóloga / no homóloga.
El rcAAV se puede replicar y amplificar en presencia de un virus auxiliar. La detección de rcAAV generalmente adopta el uso de células sensibles para la amplificación en presencia de virus auxiliares. Después de que el lisado celular se amplifica y se pasa varias veces, se usan transferencia Southern y qPCR para determinar el gen rep o cap. Por ejemplo, el producto rAAV scAAV2 / 8-LP1-hFIXco, que ha entrado en ensayos clínicos, utiliza qPCR para controlar el contenido de rcAAV a menos de 1 / 2,25 × 106. También hay informes de que al utilizar tecnología transitoria de plásmidos múltiples optimizada, el límite del contenido de rcAAV puede ser inferior a 1/108 VG

 

3.2. Elementos generales de control de calidad

El control de calidad de la producción del virus rAAV incluye el control del proceso y las pruebas de liberación del producto final (Tabla 2).

Por ejemplo: El plásmido utilizado para el envasado de virus debe estar sujeto a controles de calidad tales como identificación, contenido, pureza, residuos de ADN de la célula huésped, eficacia de transfección, endotoxina bacteriana, esterilidad, etc .;

El líquido de recolección de virus debe controlar la detección de factores extraños (estériles, micoplasmas, etc.), virus extraños, virus diana, etc .;

Los elementos de liberación de la solución madre y la preparación de rAAV generalmente incluyen apariencia, propiedades físicas y químicas (valor de pH, presión osmótica), título del virus (título físico, título infeccioso), pureza (pureza de la proteína, relación de absorbancia, residuo de ADN del huésped, residuo de ADN plasmídico). , ácido nucleico) residuo enzimático), eficacia (expresión del gen diana, actividad in vitro, actividad in vivo), seguridad
(endotoxina, estéril, rcAAV).

Además, para las preparaciones oftálmicas de rAAV, el contenido de endotoxinas no debe ser superior a 2,0 UE / dosis / ojo o 0,5 UE / ml, las partículas insolubles deben controlarse de acuerdo con las preparaciones oftálmicas (USP <789>) y las pruebas de liberación del producto deben incluir productos después de la configuración, etc.
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3.3. Método para medir la potencia

El método para determinar la potencia de los productos rAAV debe reflejar el título físico, la actividad infecciosa y la actividad biológica del virus.

Generalmente, el método qPCR se puede usar para determinar el genoma viral en la etapa inicial de los ensayos clínicos, y se pueden usar células sensibles o células diana para determinar su capacidad de infección y capacidad de expresión del producto diana para caracterizar la eficacia del producto.

Una vez realizados los ensayos clínicos clave, debe desarrollarse más el método de actividad enzimática in vitro o el método de experimento de función in vivo que refleja el mecanismo de acción del producto. Por ejemplo, después de que SPK-RP65 ingresa a los ensayos clínicos de Fase III, la eficacia del producto se calcula transfectando células indicadoras (HEK293-LRAT) y midiendo el contenido de retinol del producto de RPE65 promovido por proteasa.

Vale la pena señalar que se debe usar ADN lineal para dibujar una curva estándar para el método qPCR de determinar el genoma viral. Si se usa ADN superenrollado como referencia, el valor medido del contenido del genoma del vector es significativamente más alto que el valor real.

 

 

 

4. Análisis de 3 ejemplos de productos genéticos enumerados

En la actualidad, solo se han aprobado para su comercialización en el mundo tres productos de terapia génica de rAAV (glybera, luxturna y zolgensma). La mayoría de estos productos en China se encuentran en la etapa inicial de investigación y desarrollo, y la industria y los reguladores carecen de investigación farmacéutica y evaluación de los productos de terapia génica rAAV. Experiencia. A continuación, se analizan los puntos clave y los problemas comunes de la evaluación farmacéutica de dichos productos con base en la información divulgada en los informes de evaluación de los productos comercializados en el extranjero.

4.1, Glybera

Glybera (alipogene tiparvovec, AAV1-LPLS447X) es un producto de terapia génica rAAV2 desarrollado por Amsterdam Molecular Therapeutics que porta el gen humano LPLS447X. Se utiliza clínicamente para tratar la deficiencia de lipoproteína lipasa en adultos mediante inyección intramuscular.

Hay cambios importantes en el proceso durante el desarrollo del proceso de este producto: el proceso de producción de primera generación (AMT-010) usa el sistema de expresión HEK293, y el proceso de producción comercial (ATM-011) usa la expresión del sistema celular de baculovirus-insecto, por lo que se desarrolló la farmacia. Y estudios de comparabilidad no clínicos.

En el proceso posterior, se utilizó el modelo de reducción de escala del proceso para verificar el proceso de eliminación de virus envueltos y virus no envueltos.

El estudio de calidad realizó estudios de caracterización adecuados en 3 lotes de lotes de producción continua, incluidos: componentes (integridad / tamaño genómico, análisis de proteínas, masa molecular, proteína de la cápside); propiedades físicas (tamaño de partícula, glicosilo de partícula viral) Modificación química); estructura primaria (confirmación de secuencia, identificación de proteínas); estructura avanzada (microscopía electrónica de lentes, ultracentrifugación analítica); actividad biológica (partículas infecciosas, actividad específica, potencia), etc.

La revisión de EMEA concluyó que debido a que el líquido de recolección de células contiene una gran cantidad de baculovirus infeccioso y el proceso posterior no puede proporcionar un efecto de eliminación de virus suficiente, el solicitante debe proporcionar un informe de análisis de riesgo para la inyección clínica de ADN residual de baculovirus, y se recomienda que se libere el producto. Compruebe que se hayan añadido a los elementos de prueba elementos como residuos de baculovirus infecciosos y rcAVV.

Además, la revisión de EMEA recomienda que el proceso de producción una vez que el producto está en el mercado debería aumentar aún más el proceso de eliminación de baculovirus (como la filtración de virus) y las impurezas (ADN de la célula de envasado, genes Rep / Cap residuales, rcAAV, baculovirus infeccioso , etc.) debe aumentarse en la etapa posterior. Sensibilidad del método de detección.

 

4.2 Luxturna

Luxturna (voretigene neparvovec-rzyl, SPK-RPE65) es un producto de terapia génica rAAV-2 que lleva el gen RPE65 humano desarrollado por Spark Therapeutics, EE. UU. Se utiliza clínicamente para la inyección subretiniana para tratar la amaurosis congénita.

El producto adopta tres plásmidos para cotransfectar células HEK293 adherentes y el proceso de producción de la botella enrollable. El proceso de producción incluye: expansión celular, transfección, reemplazo de medio, recolección de solución de cultivo, filtración de flujo tangencial, homogeneización, cromatografía de intercambio iónico, centrifugación en gradiente de densidad, reemplazo y filtración del tampón de preparación, etc .;

Antes del ensayo clínico de fase III de este producto, se produjeron cambios en el sitio, el contenedor de embalaje y otros procesos, y se utilizó el método "Side-by-side" para realizar una investigación de comparabilidad de productos sobre la calidad del producto.

Los elementos de prueba de liberación de productos incluyen: elementos físicos y químicos (apariencia, pH, concentración, volumen extraíble), identificación (gen diana), contenido (concentración del genoma), eficacia (expresión del gen diana, actividad in vitro), elementos de pureza y seguridad (endotoxina) , Material particulado, estéril), etc. El ADN del huésped, el ADN plasmídico, el gen E1A y la albúmina de suero bovino y otras impurezas relacionadas con el proceso se controlan mediante investigaciones de calidad.

La FDA revisa que la estabilidad de la celda de envasado HKE293 y la estabilidad en tiempo real del producto deben continuar completándose después de la comercialización del producto.

4.3, acordema Z

Zolgensma (onasemnogene abeparvovec, AVXS-101) es un producto de terapia génica rAAV9 desarrollado por AveXis que porta el gen Survival Motor Neuron (SMN). Se inyecta clínicamente por vía intravenosa para tratar la atrofia muscular espinal en niños.

En el proceso de desarrollo de este producto, el método de evaluación de riesgos se utiliza para determinar los atributos de calidad clave de este producto en combinación con los atributos de calidad objetivo, y el modelo de reducción de escala del proceso se utiliza para determinar el espacio de diseño del proceso y la verificación del proceso;

Este producto ha sufrido cambios en el sitio, el proceso y las formulaciones antes del lanzamiento de los ensayos clínicos clave y antes del registro y la comercialización.

La FDA revisó y determinó que la pureza del producto y la efectividad de la unidad VG eran consistentes antes y después del cambio de proceso; Los elementos de prueba de "potencia" de este producto incluyen tanto la detección cuantitativa de los niveles de expresión de la proteína SMN en las células diana como la detección semicuantitativa in vivo de la "tasa de supervivencia" del ratón.

Cabe señalar que debido a la falta de precisión y exactitud del método de análisis de "contenido" de este producto durante el desarrollo de los ensayos clínicos de fase І, se utilizó un método actualizado para revisar la dosis clínica después de 44 meses. Además, en el experimento de estabilidad de este producto, se observó una disminución en el "contenido" y la "eficacia".

 

 

 

 

(fuente: internet, solo referencia)