Examine el mejor scfv para construir un vector celular CART clínicamente adecuado

 

Examine el mejor scfv para construir un vector de células CART clínicamente adecuado. Resumen. Los investigadores examinaron la biblioteca de presentación de fagos scFv derivada de células B humanas e identificaron un conjunto de clones específicos de BCMA a partir de los cuales se modificó el CAR humano.

Aunque el rango de afinidad por BCMA es muy estrecho, existen diferencias significativas en la expansión de células CAR T entre scFv únicos en experimentos repetidos de estimulación de antígenos. Estos resultados se confirmaron mediante el cribado en un modelo de xenoinjerto de MM, en el que la supervivencia de CAR in vivo se puede prefabricar a partir de ensayos repetidos de estimulación antigénica solos, eliminando la enfermedad y prolongando la supervivencia.

Los resultados del cribado identificaron una terapia de células CAR T altamente eficaz con características que incluyen una rápida expansión en el cuerpo (> 10,000 veces, en el sexto día), eliminación de la enorme carga tumoral y protección duradera contra el re-ataque tumoral.

Hemos generado el CAR de segunda generación y el vector de células T CAR derivado de este trabajo se encuentra en investigación clínica.

 

 

Introducción

Al diseñar un CAR completamente humano que integra scFv derivado de células B humanas, es posible evitar potencialmente la inmunidad anti-CAR del paciente. En este artículo, informamos sobre el desarrollo de un CAR derivado de scFv humano dirigido a BCMA. Describimos las estrategias y principios utilizados para distinguir los CAR que contienen scFv humanos únicos y para determinar las diferencias de amplificación mediadas por scFv después de la estimulación repetida de antígenos, como un método de detección particularmente útil para optimizar el diseño de CAR. Además, hemos caracterizado la cinética de expansión y acumulación de células T modificadas genéticamente con nuestro CAR principal in vivo. El constructo CAR que se dirige a BCMA humano altamente activo derivado de este trabajo se encuentra actualmente en evaluación clínica.
El proceso específico es el siguiente:

 

01 Identificar scFv anti-BCMA humano e integrarlo en el vector CAR

Vector CAR Examinamos una biblioteca de presentación de fagos scFv derivada de células B humanas (Figura S1), que contiene 6x1010 scFv con proteína de fusión Fc de inmunoglobulina G1 (IgG1) de dominio extracelular BCMA humano recombinante (BCMA-Fc), para identificar BCMA- scFv humanos específicos. Después de la secuenciación del ADN, se identificaron 57 clones específicos de BCMA únicos y diversos, que contenían CDR de cadena ligera y cadena pesada, y cada clon cubría 6 subfamilias con HCDR3 de 5 a 18 aminoácidos de longitud. El análisis de citometría de flujo confirmó la especificidad de unión del clon único a las células presentadoras de antígenos artificiales de fibroblastos murinos NIH3T3 (BCMA-aAPC) que expresan BCMA humana de longitud completa. La combinación de 17 clones con la línea celular MM humana se confirmó además mediante citometría de flujo,

El análisis de citometría de flujo después de la tinción con BCMA-Fc confirmó la expresión de CAR en la superficie celular de las células T del donante. Logramos consistentemente una eficiencia de transducción retroviral similar (50% -60%) en el scFv estudiado (Figura 1A). La mayoría de los scFv estudiados para BCMA tienen afinidades nanomolares de un solo dígito similares para BCMA (Tabla S1).

Figura (1 A) Eficiencia de transducción retroviral;
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02 Después de la estimulación repetida de antígenos entre clones scFv, las células CAR T se expandieron

Al igual que la LLA de células B [1], en el ensayo clínico de células T con CAR de MM [10], la expansión de las células T con CAR en los pacientes parece estar relacionada con la eficacia clínica. In vivo, las células CAR T deben expandirse bajo exposición continua a antígenos diana para eliminar la gran carga tumoral. Por esta razón, intentamos evaluar el potencial de expansión in vitro de las células CAR T en múltiples ciclos de estimulación antigénica. Esta prueba de estimulación de antígeno repetida reveló una diferencia sustancial en la amplificación del nuevo scFv incorporado en nuestra construcción CAR que contiene CD28, que es diferente de los clones scFv 125 y 171 incorporados en otros clones scFv [BCMA (125) y 171 respectivamente). En comparación con BCMA (171)], son scFv de amplicón superiores. Por ejemplo, en un experimento con tres donantes independientes, Las células T con CAR BCMA (171) y BCMA (125) continuaron expandiéndose de forma única después de cuatro estimulaciones, y se expandieron entre 115 y 158 veces en promedio (en comparación con cualquier otro, p <0,005 otros CAR). Ningún otro estudio de scFvs continuó extendiéndose más allá del cuarto estímulo, y la extensión máxima del cuarto estímulo se limitó a entre 2 y 30 veces (Figura 1B).

Para analizar la citotoxicidad, cuantificamos la bioluminiscencia dependiente de ATP de la diana de la línea celular OMP2MM transducida con luciferasa (ffLuc) después de 4 horas de co-cultivo con células CART [18]. La citotoxicidad para las células OPM2-ffLuc mostró que las células CART incorporaron cualquiera de los siguientes anti-BCMAscFv para estudiar la lisis de las líneas celulares MM de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, no puede distinguir la mayoría de los CAR, y BCMA (183), BCMA (171), BCMA (130) y BCMA (125) producen proporciones de célula a objetivo estadísticamente equivalentes. Solo el BCMA (137) tiene una capacidad de destrucción de células menor que otros BCMA.

(B) Repita la prueba de estimulación de antígeno;

Se colocaron células CART (dominio coestimulador de CD28) que contenían el scFv indicado en la monocapa BCMA-aAPC o CD19-aAPC. Se contaron las células CART cada 4 días y se volvió a sembrar el mismo número de células T CAR + en una nueva monocapa de aAPC (flecha). Los CAR que contienen scFv 171 y 125 anti-BCMA humanos pueden mostrar una excelente capacidad de amplificación cuando se colocan en placas sobre BCMA-aAPC;

(C) Análisis de citotoxicidad;

Se cocultivaron células CAR + T transducidas con la misma construcción que 1b con la línea celular de mieloma humano OPM2 en una relación E: T aumentada. Todos los scFv lisaron células OPM2 de una manera dependiente de la dosis. Las células CAR T enriquecidas con scFv183, 171, 130 y 125 son mejores que 137;

 

 

03 La evaluación in vivo de CAR anti-BCMA humano confirmó los resultados de las pruebas de estimulación antigénica repetidas in vitro para distinguir scFv anti-BCMA

Se implantaron ratones NSG con la línea celular MM humana con tropismo en la médula ósea OPM2.19, y una única inyección de células T del donante modificadas con el mismo CAR que se ha descrito anteriormente. Para confirmar el valor predictivo de las pruebas repetidas de estimulación de antígenos, solo BCMA (125) y BCMA (171) que contienen células CAR T pueden mejorar la tasa de supervivencia de los ratones. Las imágenes de bioluminiscencia (BLI) mostraron que la erradicación de las células OPM2-ffLuc también se restringió a los ratones tratados con células CAR T BCMA (125) y BCMA (171) (Figura 2B). Aunque los dos scFv son equivalentes en varios ensayos, elegimos BCMA (171) para caracterizar y evaluar sus efectos transcripcionales clínicos.

Al inyectar células OPM2-ffLuc por segunda vez en ratones, se evaluó que los anti-BCMACAR humanos que incorporan clones con dominios coestimuladores CD28 o 4-1BB [171] proporcionaron un nuevo ataque sobre líneas celulares MM que expresan BCMA endógenas. Por protección.

Figura 2. Las células CAR T BCMA (171) y BCMA (125) en el modelo de xenoinjerto de tumor alto MMMA prolongaron el tiempo de supervivencia y erradicaron los tumores.

La línea de células MM de médula ósea humana OPM2-ffLuc se inyectó en ratones NSG (1 x 106 células OPM2) a través de la vena de la cola, y luego se implantó y expandió durante 21 días. Se obtuvieron imágenes de los ratones mediante bioluminiscencia (BLI); aquellos pacientes con una alta carga tumoral fueron asignados al azar para no recibir tratamiento o fueron tratados con (3 × 106 CAR +) células T de donante modificadas genéticamente, estas células T de donante Igual que el CD28 (SJ25C1) o CD28 dirigido a BCMA que se muestra en la Figura 1 (A) demostraron supervivencia a largo plazo en todos los ratones que recibieron una dosis única de terapia celular CART dirigida a BCMA enriquecida con scFv 171 o 125. (B) Las células CART contra BCMA que incorporan scFv 171 y 125 eliminan de manera única la alta carga de MM determinada por BLI.

Figura 3. Independientemente del dominio coestimulador CAR de las células OPM2-ffLuc, las células CAR T dirigidas a BCMA (171) pueden proporcionar inmunidad a largo plazo (1 × 106) contra líneas celulares MM humanas y luego inyectadas en ratones NSG a través de la vena de la cola. El día 4, los ratones se trataron con una única inyección de células CAR T que contenían el dominio coestimulador CD28 o 4-1BB (1 x 106CAR +) dirigido a CD19 (SJ25C1) o BCMA (171). (A) En comparación con el tratamiento con células T con CAR CD19 (SJ25C1), el tratamiento con células T con CAR con BCMA (171) puede prolongar significativamente la supervivencia. La tasa de supervivencia entre los ratones tratados con células T CAR con BCMA (171) con diferentes dominios coestimuladores no fue significativa. (B) El día 21, los BLI ventrales y dorsales representativos mostraron que los dos grupos de células CAR T BCMA (171) eliminaron las células MM OPM2. (C) 98 días después de la inyección inicial de OPM2 (94 días después de la inyección de células CAR T), Los ratones supervivientes a largo plazo de 4a se desafiaron de nuevo con células OMP2. Al mismo tiempo, se inyectaron células OPM2 en ratones sin tratamiento previo con células CAR T en el grupo de control. Los ratones no se volvieron a tratar con células CAR T. Los ratones supervivientes a largo plazo tratados previamente con células T CAR de BCMA (171) están protegidos del re-ataque de OPM2 y continúan teniendo una supervivencia a largo plazo. (D) Las imágenes en el día 34 (130 días en total) después del re-ataque de OPM2 mostraron que había una gran carga de MM en ratones que no fueron inyectados con células CAR T, mientras que no hubo señal de OPM2 BLI en ratones que fueron tratados previamente (* p <0,001). Los ratones supervivientes a largo plazo tratados previamente con células T CAR de BCMA (171) están protegidos del re-ataque de OPM2 y continúan teniendo una supervivencia a largo plazo. (D) Las imágenes en el día 34 (130 días en total) después del re-ataque de OPM2 mostraron que había una gran carga de MM en ratones que no fueron inyectados con células CAR T, mientras que no hubo señal de OPM2 BLI en ratones que fueron tratados previamente (* p <0,001). Los ratones supervivientes a largo plazo tratados previamente con células T CAR de BCMA (171) están protegidos del re-ataque de OPM2 y continúan teniendo una supervivencia a largo plazo. (D) Las imágenes en el día 34 (130 días en total) después del re-ataque de OPM2 mostraron que había una gran carga de MM en ratones que no fueron inyectados con células CAR T, mientras que no hubo señal de OPM2 BLI en ratones que fueron tratados previamente (* p <0,001).

 

 

04 BCMA (171) Las células CAR T que se ubican rápidamente en el modelo MM establecido, acumulan y erradican tumores

Diseñamos un vector retroviral bicistrónico, que incluye BCMA (171) / 4-1BBz CAR de segunda generación y luciferasa gaussiana externa (extGLuc) para monitorear la distribución y expansión de las células T CAR en el cuerpo a lo largo del tiempo. incrementar. Demostramos que las células T extGLuc / CAR se acumulan en el sitio del tumor OPM2-ffLuc dentro de las 24 horas posteriores a la inyección. En los primeros 6 días después de la inyección, la acumulación de células T ExtGluc / CAR se expandió rápidamente en este sitio, eliminando así los xenoinjertos de MM dentro de este período de tiempo. Una vez que se aclara el antígeno, la fluorescencia de las células CAR T disminuye (Figura 4A). El sexto día después de la inyección de células T con CAR, el BLI del MM en la región femoral alcanzó su punto máximo. Desde las imágenes de 24 horas hasta la señal máxima, la señal BLI aumentó en un promedio de 14.610 veces (n = 6; el rango aumentó en 9.593-19.993 veces).

Figura 4. La cinética de la acumulación de células CAR T y de eliminación de tumores dirigidas a BCMA. Se inyectaron células OPM2-ffLuc (1106) en ratones NSG a través de la vena de la cola para producir una alta carga tumoral dentro de los 24 días hasta que se trató una sola dosis de personas para las células T (3106; día 0).

 

05 El scFv humano es específico de BCMA

La verificación de la especificidad del objetivo es crucial para los nuevos scFv con posibles aplicaciones clínicas. Se desarrolló un ensayo de unión célula-célula de citometría de flujo automatizado en el que una población de células que expresan una molécula interrogante (es decir, scFv anti-BCMA) se mezcla con células que expresan una biblioteca de moléculas de superficie celular para identificar consultas de posibles interacciones diana.

La ventaja de este método es que puede presentar dianas de composición de bibliotecas y consultas en el contexto de las membranas plasmáticas de mamíferos y tiene modificaciones e interacciones post-traduccionales cercanas a las naturales. Con este fin, expresamos transitoriamente nuestra secuencia scFv anti-BCMA en HEK293 usando una construcción de visualización de la superficie celular que contiene el mCherry citoplasmático adyacente al dominio transmembrana PD-L1 murino.

Al mismo tiempo, expresamos transitoriamente una biblioteca que consta de 395 miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas y TNFRSF, expresados ​​como fusiones de GFP C-terminales. La biblioteca solo contiene dianas que se seleccionan previamente para una alta expresión de proteínas y una correcta localización de la membrana, y representa un conjunto de dianas inmunes funcionalmente importantes.

Las poblaciones de células de banco y consulta de scFv mixtas se analizaron mediante citometría de flujo para identificar GFP doble positivo; Eventos mCherry, que representan interacciones célula-célula mediadas por scFvtarget. En nuestro panel de scFv, dos isoformas diferentes de scFv 130 y la proteína reguladora de señal (SIRP) beta-1 mostraron interacciones fuera del objetivo (Figura S2A), mientras que no se examinaron otros scFv, incluidos 171 (Figura 5). ) Muestra genes no objetivo fuera del objetivo.

Además, evaluamos el potencial de unión no específico de nuestros scFv principales a través del ensayo de cocultivo de células CAR T y células primarias aisladas de una variedad de tipos de tejidos normales básicos. Usando la liberación de interferón γ (IFN-γ) como sustituto de la participación de CAR a través de scFv, encontramos que la liberación de IFN-γ solo ocurre cuando las células CAR T se cultivan conjuntamente con la línea celular MM humana de control positivo, y la señal a- la relación de ruido es> 10,000: 1 (Figura S2B).

Figura 5. La especificidad de BCMA (171) se transfectó transitoriamente en diferentes poblaciones de células HEK293s. La posible interacción scFv / antígeno diana se identificó como una señal doble positiva mediante citometría de flujo automática. El pico etiquetado como "B" representa la interacción con el control BCMA +. A diferencia del clon 130 de scFv que interactúa con las dos isoformas de SIRP-B1 (Figura S2A), todos los demás scFv, incluido el clon 171 (mostrado), solo interactúan con BCMA.

 

 

06 Producción de vectores CAR bicistrónicos, incluido EGFRt para transcripción clínica

El receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt) se ha desarrollado previamente como un marcador seleccionable y un gen de eliminación potencial, 21 en el caso de toxicidad clínica refractaria. Generamos una construcción bicistrónica que incluye BCMA (171) / 4-1BBz CAR humana separada por un elemento P2A con EGFRt para la traducción clínica (Figura 5A). La coexpresión de CAR y EGFRt se verificó mediante análisis de citometría de flujo (Figura 5B). En presencia de cetuximab, las células CAR T se cultivaron conjuntamente con la línea de células asesinas naturales NK-92 (CD16a +), que demostró que el anticuerpo EGFR cetuximab promueve la citotoxicidad dependiente de anticuerpos de las células CAR T (ADCC). [23 ]. Las células CAR T que expresan EGFRt, cocultivadas con células NK-92 en presencia de cetuximab, pueden inducir específicamente ADCC (Figura 5C).

 

Resumir:

Después de realizar un cribado in vitro para eliminar MM de alto volumen, encontramos que las células T transducidas por CAR combinadas con el scFv líder (Figura 2) proporcionaron una protección duradera (Figura 3), y demostramos que el sitio MM es potente in vivo Amplificación y acumulación (Figura 4). EGFRt / BCMA (171) -41BBz (Figura 6) Las células CAR T se están sometiendo a evaluación clínica en un ensayo de fase I, que permite la dosificación repetida y controlará su respuesta inmune a CAR (NCT03070327). Otros vectores de células T CAR anti-BCMA derivados de este trabajo han ingresado en dos ensayos clínicos separados, a saber, el estudio multiinstitucional ICTII / IIII NCT03338972 y NCT03430011.

Figura 6. Generación y validación de la terapia de células T con CAR que contiene EGFRt / BCMA (171) -41BBz

(A) Un vector bicistrónico que contiene EGFRt y BCMA (171) / 4-1BBz separados por un elemento P2A diseñado para ser traducido clínicamente. (B) FACS muestra que EGFRt y CAR se coexpresan en las células T del donante transducidas (cuadrante V ++). (C) En presencia o ausencia de cetuximab de anticuerpo específico de EGFRt, las células CART se cultivaron conjuntamente con células CD16 + NK-92 para evaluar la función de eliminación potencial de EGFRt. Solo cuando ambos EGFRt están contenidos en el transgén y cetuximab está presente en el cocultivo, las células T CAR + tienen ADCC obvia.

 

 

 

(fuente: internet, solo referencia)