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Hablando del proceso de preparación de la vacuna de ARNm
Hablando del proceso de preparación de la vacuna de ARNm. Una nueva epidemia de corona en 2020 ha promovido y atestiguado el majestuoso impulso de los recién llegados a la vacuna de ARNm. Como estrella en ascenso, el ciclo corto de I + D, la alta seguridad, la alta precisión y la alta flexibilidad de las vacunas de ARNm ocupan una ventaja absoluta en comparación con las vacunas tradicionales.
El ARNm que codifica la proteína antigénica se introduce en células animales humanas y la proteína antigénica se sintetiza a través del sistema de expresión de la célula huésped para inducir al huésped a producir una respuesta inmune a la proteína antigénica, es decir, una vacuna de ARNm.
Con la comercialización de las vacunas de ARNm, su proceso de producción está madurando gradualmente. El diagrama de flujo del proceso de preparación específico se muestra a grandes rasgos en la Figura 1.
Figura 1. Diagrama de flujo del proceso de preparación de la vacuna de ARNm
- Preparación de plásmido lineal
- Transcripción in vitro y reacción de taponamiento de ARNm
- Captura específica
- Reacción de taponamiento
- Purificación fina
- Entrega por transportista
1) Preparación de plásmido lineal
El proceso de preparación de ADN es bastante sofisticado en comparación con el ARNm. Es como el método de plásmido de tres pasos clásico de Cytiva, que tiene una gran versatilidad, una gran robustez y se puede amplificar por completo, lo cual es un buen proceso de preparación de plásmidos. La tecnología emergente RCA (Rolling Circle Amplification) prepara plásmidos lineales (que se muestran en la Figura 2), simplificando el complejo. El proceso no requiere la participación de las células en absoluto, eliminando así el proceso de fermentación, expresión, recolección y purificación de E. coli, acortando el tiempo de proceso de 7 a 8 días a 1 a 2 días, mejorando enormemente la eficiencia del trabajo.
Figura 2. Preparación de RCA de plásmidos lineales
2) Transcripción in vitro y reacción de taponamiento de ARNm
El proceso de reacción in vitro de transcripción y protección del ARNm es más seguro y más rápido que la mayoría de los otros métodos de producción de vacunas, pero las materias primas de las que depende son relativamente caras. La transcripción in vitro de ARN generalmente usa ADN plasmídico u otros fragmentos de ADN que contienen el marco de lectura abierto de la proteína diana como plantilla, agregando nucleósidos trifosfatos (adenina, guanina, citosina, uracilo) que proporcionan bases de nucleótidos y enzimas de polimerización de ARN, inhibidores de ribonucleasa , pirofosfatasa (que degrada el pirofosfato para prevenir la inhibición de la transcripción), iones de magnesio (como cofactor de la polimerasa) y tampones que contienen antioxidantes y poliaminas. En la actualidad, el proceso de transcripción in vitro se produce en masa en condiciones GMP. Hay que decir que sigue siendo un gran desafío.
Figura 3. Transcripción in vitro de ARN
3) Captura específica
El proceso de captura después de la transcripción in vitro de ARNm o el proceso de captura después de la protección ha sido relativamente claro.
Las perlas magnéticas Sera-Mag Oligo (dT) (Cytiva) pueden unirse a colas de ARNm poli A con alta especificidad para capturar ARNm. La carga puede alcanzar 12 ug mRNA / ml y el rendimiento es superior al 90% (Figura 4). Sin embargo, para la producción de GMP a gran escala, debido al proceso de operación y al costo, la aplicación de amplificación de perlas magnéticas es relativamente limitada.
Figura 4. Sera-Mag Oligo (dT) captura ARNm con alta especificidad
CIMmultus Oligo dT (separaciones BIA) también puede capturar ARNm de manera eficiente al combinarse con una cola de poli A, y tiene una alta tasa de flujo (el tiempo de retención es de aproximadamente 1 min), baja fuerza de corte, capacidad de carga de hasta 180 ug / ml y el rendimiento este paso es tan alto como Más del 95% (Figura 5).
Figura 5. CIMmultus OligodT captura ARNm con alta especificidad
El principio de POROS Oligo (dT) 25 (Thermo Fisher) es también capturar de manera eficiente la cola poli A de ARNm. Para ARNm de 1000 n, 2000 n y 3000 n, la capacidad de carga es tan alta como mg / ml y el rendimiento es superior al 90%. Correspondiente a un punto de flujo del 10%, la capacidad de ARNm de 3000 nt puede ser tan alta como 3 mg / ml, y el rendimiento es ~ 92% (Figura 6).
Figura 6. POROS Oligo (dT) 25 captura ARNm con alta especificidad
4) purificación fina
Después del paso de captura de alta especificidad, el paso de reemplazo de líquido de fibra hueca normalmente se puede conectar para reemplazar el tampón mientras se eliminan impurezas como pequeños fragmentos de ácido nucleico. El efecto es más significativo para ARN grandes, generalmente logrando un alto rendimiento del 90% -95%, e incluso una alta pureza del 99%, al tiempo que conserva la estabilidad y el efecto del ARN purificado.
Para algunos proyectos que desafían las impurezas, CIMmultus PrismaS tiene efectos tanto de intercambio aniónico como hidrofóbicos. En condiciones de elución de gradiente de pH, el ADN, las proteínas residuales y el dsRNA pueden separarse eficazmente del ssRNA diana. Las impurezas precederán. Se eluye el ssRNA. Si se agrega un paso de elución con alto contenido de sal (como NaCl 1 M) antes de la elución del pH, será más propicio para la eliminación de dsRNA, ADN y proteínas.
Figura 7. ARNm refinado de CIMmultus PrismaS
5) entrega del transportista
Para el ARNm, su sistema de entrega de ARNm es la máxima prioridad para que pueda desempeñar su función de manera eficaz. Hay muchos factores que afectan al sistema de administración de ARNm, como la eficacia de la traducción, el adyuvante, la dosificación, etc. Desde la protamina temprana como vehículo de administración hasta el vehículo de administración de nanopartículas lipídicas (LNP) actual, la tecnología de transporte de ARNm ha dado un salto adelante.
En la actualidad, todos los sistemas de administración de ARNm en ensayos clínicos son nanopartículas de lípidos, y el diagrama de estructura se muestra en la Figura 8. Tanto las vacunas de ARNm de moderna como las vacunas de ARNm de Pfizer-BioNTech que se han comercializado también utilizan nanopartículas de lípidos como vehículos de administración. Por supuesto, la tecnología del vector de administración todavía se está desarrollando rápidamente, y el desarrollo de la plataforma de tecnología LPP mRNA con una estructura única de doble capa está trabajando arduamente para mejorar el proceso de producción de la vacuna mRNA.
Figura 8. Estructura de nanopartículas de liposomas y vehículo de administración de ARNm
En resumen, todavía queda un largo camino por recorrer para construir una plataforma de proceso de preparación de vacunas de ARNm madura, sólida y económica.
(fuente: internet, solo referencia)
(fuente: internet, solo referencia)