Las células duoCAR-T tri-específicas pueden tratar eficazmente cánceres heterogéneos de antígeno

 

Las células duoCAR-T tri-específicas pueden tratar eficazmente cánceres heterogéneos de antígeno. Science Sub-Journal: ¡El tumor no tiene dónde escapar! Los estudios preclínicos han demostrado que las células duoCAR-T tri-específicas pueden tratar eficazmente cánceres heterogéneos de antígeno. 

 

Con la terapia de células T (CAR-T) del receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a CD19 (célula T CAR19) y CAR-T dirigido a CD22 La aparición de la terapia celular (células T CAR22) ha mejorado significativamente el tratamiento de la leucemia de células B y linfoma. Sin embargo, la recurrencia después de la terapia con células CAR-T sigue siendo un obstáculo, y hasta el 50% de los pacientes que reciben terapia con células T CAR19 recaen durante el primer año después del tratamiento, y un número considerable de estos pacientes con recaída muestran pérdida del antígeno CD19.

De manera similar, la recurrencia de las células T CAR22 después del tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (LLA) está relacionada con la regulación a la baja de la proteína CD22 de las células tumorales malignas, por lo que las células T CAR22 ya no pueden reconocerlas ni matarlas. En el proceso de usar la terapia con células T CAR19 y luego usar la terapia con células T CAR22, también se ha informado la pérdida secuencial de antígenos de superficie tumoral CD19 y CD22 en el linfoma difuso de células B grandes. De manera similar, durante el tratamiento con el anticuerpo dirigido contra CD20 rituximab (Rituximab), se ha informado pérdida del antígeno CD20 en el linfoma no Hodgkin, la leucemia linfocítica crónica (LLC) y el linfoma folicular.

Para resolver el problema del escape de antígenos tumorales, los investigadores de Lentigen en los Estados Unidos han desarrollado previamente una construcción CAR20-19 biespecífica en tándem dirigida a antígenos CD19 y CD20, y se ha mostrado prometedora en ensayos clínicos de fase 1. Eficacia y tolerabilidad.

Se especula que el uso de células CAR-T multiespecíficas para apuntar a células tumorales reduce el escape de antígenos tumorales y mejora el efecto terapéutico. Anteriormente, los investigadores de Lentigen habían confirmado en un modelo de xenoinjerto de ratón humanizado que las células duoCAR-T (células CAR-T duales, es decir, células T que expresan dos CAR conectadas en serie) son mejores que monoCAR para controlar la infección por VIH. Las células -T (células CAR-T individuales, es decir, células T que expresan una sola CAR) son más efectivas.

Ahora, en un nuevo estudio, los investigadores de Lentigen permitieron que los vectores lentivirales que expresan CAR en tándem dirigidos a CD19 y CD20 transduzcan las células T CD4 + primarias y las células T CD8 +. Los CAR en tándem expresados ​​se combinan con péptidos de autoescisión de P2A. Los monoCAR que se dirigen al antígeno CD22 están operativamente unidos entre sí, y las células duoCAR-T tri-específicas se desarrollaron basándose en esto, y se evaluó la capacidad de estas células duoCAR-T tri-específicas para resolver el problema del escape del antígeno. Los resultados de la investigación relacionada se publicaron recientemente en la revista Science Translational Medicine, con el título del artículo “CD19-CD20-CD22 triespecíficos dirigidos a células duoCAR-T que eliminan tumores de células B heterogéneos con antígeno en modelos preclínicos”.

Estos autores construyeron 4 construcciones duoCAR (denominadas D1, D2, D3 y D4). Los dos marcos de lectura abiertos de cada construcción se separaron mediante un péptido P2A. Sus perfiles de expresión en la superficie de las células T se muestran en la figura. 1 mostrado. DuoCAR D1 consta de dominios de unión de fragmentos de región variable de cadena única en tándem (scFv) dirigidos a antígenos de células B CD19 y CD20, dominios bisagra y transmembrana derivados de CD8, dominio coestimulador de ICOS, dominio de activación de CD3 y CD3 Después del dominio de activación, la primera generación del gen CAR que se dirige a CD22, se componen el dominio bisagra y transmembrana derivado de CD8, y el dominio de activación de CD3.

D2 es igual que D1, excepto que se usa el dominio OX40 en lugar del dominio coestimulador ICOS. D3 contiene el mismo gen CAR en tándem dirigido a CD19 y CD20 que la construcción D2. El gen CAR en tándem es seguido por un gen CAR dirigido a CD22, el dominio coestimulador de ICOS de segunda generación y el dominio de activación de CD3. D4 contiene un gen CAR en tándem dirigido a CD20 y CD19 y un dominio coestimulador de CD27. También contiene una base CAR dirigida a CD22 y un dominio coestimulador ICOS. Además, a cada dominio coestimulador le sigue un dominio de activación de CD3.

Figura 1. Diseño, expresión y caracterización del dicistrónico DuoCAR D1, D2, D3 y D4. Imagen de Science Translational Medicine, 2021, doi: 10.1126 / scitranslmed.abc6401.

Cada construcción duoCAR se transdujo en células T humanas primarias, obteniendo así células T duoCAR D1, células T duoCAR D2, células T duoCAR D3 y células T duoCAR D4, y proliferando in vitro durante 8-10 días. Según cuatro experimentos de transducción independientes, la expresión media de duoCAR D1 fue del 64%, D2 fue del 56%, D3 fue del 60% y D4 fue del 45%. Estos autores pueden continuar produciendo células duoCAR-T, y estas células duoCAR-T no tienen ninguna evidencia indeseable de activación espontánea, falla o diferenciación terminal.

Figura 2. DuoCAR D1, D2, D3 y D4 tienen una fuerte toxicidad específica para las células tumorales in vitro. Imagen de Science Translational Medicine, 2021, doi: 10.1126 / scitranslmed.abc6401.

Utilizaron las líneas de células tumorales Raji (CD19 + CD20 + CD22 +) y REH (CD19 + CD20-CD22 +) para pruebas in vitro y encontraron que, en comparación con las células monoCAR-T, las células T duoCAR lisan las células Raji y las células REH de manera más eficaz, pero No existe la línea celular 293T (CD19-CD20-CD22-) negativa para el antígeno diana de lisis de células T duoCAR, lo que indica que este efecto de destrucción del tumor no es independiente del antígeno (Figura 2). Además, también encontraron que estas cuatro células duoCAR pueden expresar específicamente cualquier combinación de los tres antígenos de superficie (CD19, CD20 y CD22) (como expresar solo uno de ellos, solo dos de ellos, y expresar estos tres antígenos de superficie) de células tumorales (Figura 5).

Figura 5. Estudio de citotoxicidad in vitro de células CAR-T para células diana de ingeniería de antígenos. Imagen de Science Translational Medicine, 2021, doi: 10.1126 / scitranslmed.abc6401.

También recogieron el sobrenadante de las células T duoCAR cuando se cultivaron junto con la línea celular Raji in vitro y midieron las citocinas solubles secretadas por las células T duoCAR en el sobrenadante. Descubrieron que las células T duoCAR producen citocinas IL-2, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF e IL-9, además de IL-4 hasta cierto punto. Como se esperaba, las células T que no fueron transducidas con vectores lentivirales portadores de CAR (en lo sucesivo, células T UTD) no produjeron citocinas, lo que confirma que la producción de dichas citocinas depende de CAR (Figura 3).

Figura 3. Citocinas liberadas por CD22 + CAR-T cuando se co-cultivan con la línea celular CD19 + CD20 + Raji. Imagen de Science Translational Medicine, 2021, doi: 10.1126 / scitranslmed.abc6401.

Luego, probaron la eficacia de las células duoCAR-T in vivo. Con este fin, probaron las células duoCAR-T en el modelo de ratón de xenoinjerto de tumor Raji NHL y el modelo de ratón NALM-6 ALL. En estos dos modelos de ratón, cada modelo mostró un fenotipo de expresión de antígeno CD19 + CD20 + CD22 + triple positivo. En el modelo de ratón con xenoinjerto de tumor Raji NHL, la dosis de células duoCAR-T inyectadas en cada ratón se dividió en dosis alta (5 x 106) y dosis baja (2 x 106). Se encontró que en el grupo de dosis alta, estas cuatro células duoCAR-T comenzaron a inhibir significativa y fuertemente el crecimiento del tumor Raji en el día 14, y en el grupo de dosis baja, estas cuatro células duoCAR-T podían controlar a Raji. peso de tumor. En el modelo de ratón NALM-6 ALL, estas cuatro células duoCAR-T mediaron un rechazo significativo del tumor (Figura 4).

Figura 4. Las células DuoCAR-T erradican los tumores de células B en modelos de xenoinjerto de linfoma y leucemia. Imagen de Science Translational Medicine, 2021, doi: 10.1126 / scitranslmed.abc6401.

Además, para probar la función antitumoral de las células duoCAR-T contra mutantes de células tumorales con antígenos faltantes, se implantaron ratones NSG con 5 × 106 células Raji (compuestas por células Raji19KO, células Raji20KO, células Raji22KO y células Raji parentales , cada célula de semilla representó el 25%). Esta mezcla de células Raji representa un tumor heterogéneo antigénico. En este tumor, algunas células tumorales pierden la expresión del antígeno diana hasta cierto punto.

Por ejemplo, las células Raji19KO no expresan CD19, las células Raji20KO no expresan CD20, las células Raji22KO no expresan CD22 y la pérdida de la expresión de este antígeno diana evitará la activación de las células CAR-T correspondientes y la inmunidad antitumoral. Siete días después de la inyección de esta mezcla de células Raji, estos ratones recibieron 5 x 106 células T duoCAR D1 / D2 / D3 / D4 y células monoCAR-T como control. El día 14, encontraron que estas cuatro células T duoCAR rechazaban fuertemente los tumores Raji con heterogeneidad antigénica, y al final del estudio, estos ratones todavía estaban en remisión. Por el contrario, las células monoCAR-T no pudieron controlar la carga tumoral en los ratones del grupo de control (Figura 6).

Figura 6. Actividad antitumoral y durabilidad de duoCAR in vivo en un modelo de tumor Raji heterogéneo de antígeno. Imagen de Science Translational Medicine, 2021, doi: 10.1126 / scitranslmed.abc6401.

Además, también encontraron que cuando se combinan con antígenos de superficie en las células diana, en comparación con el diseño monoCAR, las construcciones duoCAR pueden fosforilar CD3 de manera robusta y activar las proteínas de señalización aguas abajo Akt y MAPK p38, así como el mediador de señalización remota STAT5. Además, este diseño de duoCAR conserva las características de activación clave del monoCAR homólogo, y la amplitud de activación es mínima o no disminuye.

 

 

Conclusión:

Este estudio confirmó la alta funcionalidad de las células duoCAR-T in vitro e in vivo. Este enfoque aborda ampliamente el problema acuciante de la heterogeneidad de los antígenos. Además, estos autores descubrieron una combinación inesperada de los mejores dominios coestimuladores que no incluían dominios CD28 o 4-1BB, lo que indica que los científicos tienen un gran interés en la transducción de señales de células T asociada con alta actividad y persistencia a largo plazo.

La comprensión continúa mejorando. Antes de que se considere que el método CAR-T está realmente optimizado, la activación (como lo indica la fosforilación de CD3), la persistencia a largo plazo (como lo indica la activación de Akt) y la respuesta a señales fisiológicas generalmente mediadas por citocinas (como la fosforilación de STAT5).

Además, a partir de la fosforilación de p38 y Erk1 / 2, la reducción de algunas señales de activación en duoCAR indica que la activación inicial máxima puede no estar relacionada con el control de la enfermedad.

El método de células duoCAR-T desarrollado en esta investigación se mejora sobre la base de la terapia de células CAR-T actual, superando los desafíos clínicos de la heterogeneidad tumoral y el escape de antígenos tumorales, al tiempo que mantiene una alta eficacia y durabilidad antitumorales.

 

 

(fuente: internet, solo referencia)