PROTAC: Tendencias de la investigación en los próximos diez años

 

PROTAC: Tendencias de la investigación en los próximos diez años

 

PROTAC: Tendencias de investigación en los próximos diez años. Desde que se probó en 2001 que la quimera dirigida a la degradación de proteínas (PROTAC) puede regular la función de la proteína manteniendo el sistema de proteasa de ubiquitina (UPS), ahora PROTAC ha pasado por las dos primeras décadas de rápido desarrollo.

El PROTAC basado en péptidos desarrollado anteriormente tiene una permeabilidad de membrana deficiente, y cada vez más PROTAC se diseñan en base a fármacos de moléculas pequeñas para la degradación de proteínas de membrana y la degradación de proteínas intracelulares.

El éxito de PROTAC ha promovido el desarrollo de todo el campo de la degradación de proteínas dirigida (TPD), y la vía de degradación también se ha extendido a los lisosomas LYTAC, autofagia AUTAC y ATTEC. Este artículo se centra en las tendencias de investigación actuales de PROTAC y mira hacia el futuro.

 

01 Sistema de ubiquitina-proteasoma y "impulsado por eventos"

En 2004, el Premio Nobel de Química fue otorgado a los científicos israelíes Aaron Ciechanover, Avram Hershko y al científico estadounidense Irwin Rose por su descubrimiento de que las células limpian proteínas anormales a través de procesos de degradación de proteínas regulados por ubiquitina (Ubiquitina, Ub). La ubiquitina es una clase de péptidos pequeños conservados evolutivamente, que contienen 76 aminoácidos y un tamaño de aproximadamente 8,6 kDa. La modificación de ubiquitinación de la proteína implica una serie de reacciones de la enzima activadora de ubiquitina E1, la enzima conjugadora de ubiquitina E2 y la ubiquitina ligasa E3. Primero, bajo la condición de suministro de energía de ATP, la enzima E1 se adhiere al residuo de Cys en la cola de la molécula de ubiquitina para activar la ubiquitina. Luego, E1 transfiere la molécula de ubiquitina activada a la enzima E2. La enzima E3 reconoce la proteína diana en conjunto y la modifica por ubiquitinación. De acuerdo con la relación relativa de E3 a la proteína diana, se puede dividir en modificación de monoubiquitinación y modificación de poliubiquitinación.

Basados ​​en el principio de ubiquitinación, los químicos médicos propusieron el concepto de PROTAC ya en 2001. Al diseñar un ligando que se une a la proteína diana en un extremo, y un ligando que se une a la ubiquitina ligasa E3 en el otro extremo, se conectan con un enlazador para acercar la proteína objetivo y la enzima E3 en el cuerpo, de modo que la proteína objetivo se marque con ubiquitina y luego se degrade a través de la vía ubiquitina-proteasoma. A diferencia del "impulso de ocupación" de los inhibidores de moléculas pequeñas y los anticuerpos que necesitan ocupar el sitio activo de la proteína diana para bloquear su función, la degradación de la proteína diana por PROTAC es "impulsada por eventos", es decir, solo es responsable de desencadenando la enzima E3 y la proteína diana. Unión, sin ocupar espacio y sin necesidad de inhibir la proteína diana. Por lo tanto,

La capacidad de PROTAC para degradar la proteína diana está relacionada con el complejo ternario formado transitoriamente por la “proteína diana-PROTAC-E3 ligasa”. Los estudios han encontrado que, aunque a veces los ligandos utilizados para seleccionar proteínas como diana tienen baja afinidad, siempre que puedan formar un complejo ternario, el PROTAC diseñado todavía tiene una buena degradabilidad. Por ejemplo, el laboratorio Crews diseñó una vez PROTAC para la quinasa p38α. Aunque Foretinib tiene una afinidad por la p38α quinasa a un nivel de 10 µM, el PROTAC diseñado tiene un mejor efecto de degradación sobre la p38α quinasa (DC50 = 210 nM). Después de que PROTAC induce la ubiquitinación de la proteína diana, se disocia rápidamente y participa en la formación del siguiente complejo ternario.

 

 

02 Degradación de proteínas diana difíciles

Los PROTAC han avanzado gradualmente en objetivos que en el pasado eran difíciles de ser medicamentos, como la proteína de andamio FRS2α (2013), el complejo de proteínas BAF (2019), el factor de transcripción STAT3 (2019), la proteína de la familia Ras (2020), etc. y también avanzará en el futuro. Se hace posible la degradación de más objetivos que no se pueden recetar.

FRS2α es una proteína de andamio importante en el proceso de diferenciación neural y participa en la vía MAPK mediada por el factor de crecimiento nervioso NGF. El proyecto Crews intentó diseñar una quimera de péptido permeable a la membrana TrkAPPFRS2a ya en 2013. La estructura contiene la secuencia reconocida por FRS2α y la secuencia reconocida por la ligasa E3 VHL, pero su concentración es tan alta como 50 μM o más, y el el efecto no se agota Agradable.

La cromatina es un portador de información genética eucariota, y la regulación estable de su estructura es esencial para muchos procesos biológicos como la replicación del ADN, la transcripción y la reparación del daño genético. El complejo de remodelación de cromatina dependiente de ATP BAF / PBAF cambia la posición y composición de los nucleosomas mediante deslizamiento y eliminación para lograr la regulación dinámica de la estructura de la cromatina. Aproximadamente el 20% de los tumores están mutados con este complejo. estrechamente relacionada. El estudio encontró que dos ATPasas en el complejo: SMARCA2 / 4 son posibles objetivos del tratamiento del cáncer. Los investigadores conectaron el inhibidor de bromodominio SMARCA2 / 4 al ligando de ligasa de ubiquitina VHL E3 a través de un enlazador para formar una molécula PROTAC que degradó con éxito SMARCA2 / 4 y demostró que tiene un efecto de proliferación antitumoral en líneas celulares de AML.

El desarrollo de fármacos que se dirigen a factores de transcripción a menudo se ve afectado por la permeabilidad de la membrana y la gran superficie de interacción proteína-proteína (PPI) del complejo, lo que dificulta la preparación de fármacos. Ya hace más de diez años, se ha informado de pequeñas moléculas que pueden dirigirse al dominio SH2 de STAT3, pero debido a su baja eficacia y falta de selectividad como inhibidores, no resolvieron problemas prácticos. Recientemente, la molécula PROTAC SD-36 formada uniendo la molécula de dirección STAT3 SI-109 y lenalidomida puede degradar con éxito la proteína STAT3 en líneas celulares de leucemia e inducir la muerte celular. Lo que es más interesante es que la selectividad de la molécula SI-109, que originalmente no era sobresaliente, también se mejora después de haber sido diseñada como un degradante PROTAC.

Las mutaciones en la proteína RAS ocurren en el 25% de los tumores y son un objetivo prometedor. Sin embargo, debido a su falta de bolsillos efectivos y alta afinidad por GTP, se ha utilizado como un "objetivo no drugable" durante mucho tiempo. En los últimos años, los inhibidores covalentes diseñados para mutaciones KRAS G12C proporcionan una nueva idea para atacar mutaciones RAS. Los fármacos representativos AMG 510 y MRTX849 han entrado en la etapa clínica. Sin embargo, el uso de inhibidores de KRAS G12C a menudo hace que las células tumorales desarrollen tolerancia de otras formas. Por lo tanto, es necesario desarrollar una degradación dirigida de la proteína RAS. El grupo de investigación de Crews intentó utilizar MRTX849 como una pequeña molécula dirigida a KRAS, sintetizó una serie de PROTAC e identificó LC-2 eficaz. LC-2 puede degradar rápida y continuamente KRAS G12C con un DC50 de 0,25 a 0,76 μM. Investigaciones posteriores encontraron que LC-2 no podía inhibir la vía aguas abajo de KRAS, y en comparación con MRTX849, el efecto de proliferación antitumoral no mejoró. La razón puede ser que el uso del inhibidor covalente MRTX849 hace que se pierdan las propiedades catalíticas de los PROTAC.

 

 

03 Buscando ligandos de moléculas pequeñas para diseñar PROTAC

Encontrar ligandos novedosos para las proteínas diana es un núcleo importante de la tecnología PROTAC. El experimento de competición químico-proteómica y la tecnología de biblioteca de compuestos codificados por ADN (DEL) son respectivamente métodos de exploración ventajosos para descubrir ligandos de unión covalentes y no covalentes. Entre ellos, la tecnología DEL la está realizando actualmente la industria farmacéutica líder en Chengdu. Los principios técnicos relevantes se pueden encontrar en un artículo sobre otras cuentas públicas, y no lo repetiré aquí (haga clic en el enlace).

El flujo básico del experimento de competición químico-proteómica se muestra en la figura: Se incuban células enteras que contienen proteína, lisados ​​celulares e incluso tejidos animales con el compuesto a ensayar y el grupo DMSO se utiliza como control. Una vez finalizado, se combina con un agente de unión covalente panespecífico con una etiqueta de alquinilo (por ejemplo: yodoacetamida que puede reconocer Cys). Luego, etiquete el Click con un peso molecular grande en el grupo de muestra y etiquete con un peso molecular pequeño en el grupo Click en el grupo de control. Después de mezclar los dos grupos de muestras 1: 1, enriquecimiento con avidina, digestión con tripsina, fragmentación TEV de Biotin-AV. Las proteínas purificadas con etiquetas de diferentes pesos moleculares se identifican mediante espectrometría de masas. Una relación peso / peso mayor indica que la proteína está unida covalentemente al compuesto, y la proteína es un objetivo potencial para la unión covalente. Una relación de peso ligero a 1 significa que ningún compuesto está unido covalentemente. Con este esquema, el equipo de investigación de Nomura identificó con éxito el ligando covalente EN4 para el objetivo Myc.

 

 

04 Desarrollar más ligasas de ubiquitina E3 que se puedan utilizar para el reclutamiento

En comparación con encontrar ligandos de moléculas pequeñas para POI, encontrar los ligandos de la ubiquitina ligasa E3 es en realidad más difícil y más accidental. Hay dos razones principales: una es que no hay mucho conocimiento sobre la estructura de la ligasa E3; la otra es La pequeña molécula que encontramos debe ser capaz de apuntar a la ubiquitina ligasa E3 sin afectar su actividad. Por lo tanto, la ubiquitina ligasa E3 que se usa actualmente principalmente todavía usa los clásicos (como VHL, CRBN, MDM2, clAP, etc.), pero con la profundización de la comprensión del papel relativo de los sustratos de ubiquitina ligasa E3 y el avance de las técnicas de detección. Creo que se descubrirán más ligandos que puedan reclutar ubiquitina ligasa E3.

La figura anterior es la estructura de ligando actual utilizada para reclutar diferentes ligasas de ubiquitina E3. CRBN y VHL son las ligasas de ubiquitina E3 más utilizadas. Entre ellos, la talidomida, la pomalidomida y la lenalidomida se han utilizado ampliamente para diseñar y reclutar la degradación dirigida de la ubiquitina ligasa de CRBN. En la etapa inicial, el ligando utilizado para reclutar VHL era un péptido que imita su sustrato natural HIFα. Más tarde, los investigadores descubrieron que el ligando de afinidad débil (nivel 10 μM) de VHL también se puede usar de manera efectiva para la degradación dirigida. Se ha informado que la degradación de la actividad puede incluso alcanzar el nivel nanomolar. Este fenómeno puede implicar que la alta afinidad del ligando de la ligasa E3 y la ligasa E3 no es necesariamente necesaria.

Las ubiquitina ligasas MDM2, cIAP y AhR se han utilizado en el campo de la degradación dirigida durante muchos años, pero en comparación con CRBN o VHL, estas ubiquitina ligasas no se utilizan ampliamente en la actualidad. En los últimos años, con el descubrimiento de cada vez más inhibidores de la interacción proteína-proteína MDM2-p53, también se ha desarrollado más la degradación dirigida de la ubiquitina ligasa MDM2 restante. Vale la pena señalar que los PROTAC diseñados en base a cIAP, MDM2 y AhR no solo pueden degradar las oncoproteínas, sino también inducir la apoptosis al degradar el cIAP, regular al alza p53, etc., y aumentar sinérgicamente el efecto de la proliferación de células antitumorales.

También se ha informado que recluta DCAF16, RNF114 y RNF4 con función de ubiquitina ligasa a través de ligandos covalentes de moléculas pequeñas para la degradación de proteínas dirigida. Nimbolide es un compuesto triterpenoide extraído naturalmente con efectos farmacológicos en la prevención y el tratamiento de tumores. Explorando su mecanismo, se encuentra que se puede combinar con C8 de RNF114. Los PROTAC diseñados por investigadores con nimbolide y el inhibidor de diana de BRD JQ1 tienen actividad de degradación nanomolar en BRD4 y pueden ejercer un efecto sinérgico similar al MDM2 al estabilizar factores supresores de tumores como p21. Aunque se han obtenido buenos resultados experimentales, pero limitados a la fuente natural de nimbolide, encontrar un ligando alternativo sintético para RNF114 es la clave para su amplio uso. PROTAC desarrollados con DCAF16, RNF114,

Los PROTAC diseñados en base a ligandos covalentes reversibles POI se han verificado con éxito en objetivos BTK. Con el fin de verificar aún más si es posible diseñar PROTAC basados ​​en el ligando covalente reversible de ubiquitina ligasa E3, los investigadores vincularon bardoxolona con el aceptor de α-cianoenona hetero-Michael reversible a JQ-1 para diseñar PROTAC La molécula CDDO-JQ1 degradada con éxito BRD4 mediante la contratación de KEAP1, que también verificó su viabilidad.

La indistinguibilidad de PROTAC entre el sitio enfermo y el sitio normal de la POI es un gran peligro oculto que conduce a su toxicidad sistémica. Los estudios han demostrado que hay no menos de 600 ligasas de ubiquitina E3 en el proteoma humano, algunas de las cuales son específicas de tejido y enfermedad. En la siguiente etapa del desarrollo de PROTAC, si las características de distribución de la ubiquitina ligasa E3 pueden usarse para mejorar la selectividad de tejido / enfermedad de la degradación de PROTAC, se mejorará la seguridad de PROTAC.

Un ejemplo clásico es: BCL-XL es una proteína anti-apoptótica relacionada con BCL2, que es esencial para la supervivencia de las plaquetas. Mientras inhibe BCL-XL, navitoclax, el inhibidor de BCL-XL, puede causar trombocitopenia limitante de la dosis al degradar el BCL-XL plaquetario, lo que limita su uso clínico. Teniendo en cuenta la baja expresión de las ligasas de ubiquitina E3 como VHL, CRBN y cIAP en las plaquetas, los investigadores de la Universidad de Florida y el MD Anderson Cancer Center utilizaron estas ligasas E3 para diseñar la degradación dirigida de BCL-XL PROTAC degrada selectivamente BCL-XL en el tumor. células y reduce la toxicidad plaquetaria. Para obtener más información sobre la especificidad tisular de la ubiquitina ligasa E3, consulte la base de datos HμMan Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/).

 

 

05 Mejorar la eficiencia del descubrimiento PROTAC

En los últimos 20 años, aunque PROTAC ha hecho grandes avances, los principales métodos de descubrimiento no han sido significativamente innovadores: el diseño preliminar de compuestos cambiando el tipo de enlazador, la longitud, el tipo de ligando y la posición de la conexión, a través de experimentos celulares y experimentos de Wsetern. determinar la actividad de degradación de proteínas, obtener un compuesto principal activo y luego realizar un ciclo varias veces para optimizar la actividad. Este método de optimización iterativo requiere mucho tiempo y trabajo. Si las ideas de diseño basadas en estructuras utilizadas en el diseño de inhibidores de moléculas pequeñas se pueden utilizar como referencia en el próximo proceso de desarrollo de PROTAC, el proceso de descubrimiento de PROTAC se acelerará.

5.1 Diseño PROTAC basado en estructura compuesta ternaria

Estudios anteriores han demostrado que la formación de complejos ternarios es extremadamente importante para la degradación de proteínas diana. Mientras PROTAC forme un complejo ternario fuerte con POI y reclute ubiquitina ligasa E3, incluso PROTAC se une débilmente a POI (> 1 μM). POI se degrada. En 2017, los investigadores informaron del primer caso de la estructura compleja ternaria formada por la molécula PROTAC MZ1 con VHL y BRD4BD2. Los resultados mostraron que MZ1 provocó que VHL y BRD4BD2 formaran una nueva interacción proteína-proteína (PPI). Los resultados experimentales de ITC muestran que la formación de complejos ternarios mediada por MZ1 tiene un efecto sinérgico positivo, y el efecto sinérgico positivo está relacionado con la producción de PPI. Además, la existencia del enlazador puede promover la formación de PPI al acercar VHL y BRD4BD2.

En los últimos años se han resuelto las estructuras de más de diez complejos ternarios. La característica común es la aparición de nuevos IBP y la existencia de cadenas flexibles que hacen que la ligasa POI y E3 estén juntas. Otros estudios han encontrado que la reducción de la flexibilidad del enlazador regulando el PPI del complejo ternario puede afectar la selectividad y eficacia de PROTAC para POI. Con el descubrimiento de PROTAC más rígidos, se pueden utilizar métodos biofísicos para comparar la cinética de unión de PROTAC flexibles y rígidos para comprender cómo la rigidez afecta la asociación / disociación del complejo ternario ligasa / POI E3 establecido.

5.2 Modelado molecular y diseño PROTAC basado en cálculos

La investigación sobre los complejos ternarios PROTAC no solo proporciona ideas para el diseño de fármacos basados ​​en la estructura y proporciona una base para revelar el mecanismo molecular de la formación de complejos ternarios, sino que también permite diseñar programas informáticos para predecir la formación de complejos ternarios PROTAC. En la actualidad, se han reportado modelos matemáticos utilizados para caracterizar la formación de complejos ternarios, que pueden predecir la máxima concentración, cinética de asociación y disociación de los complejos ternarios formados en base a la afinidad en un estado de equilibrio.

Sin embargo, el proceso de degradación real no está equilibrado estáticamente, sino que es un proceso de flujo continuo. Por lo tanto, para resolver el problema de que el modelo anterior no puede describir con precisión la cinética de degradación de la rápida renovación y desubiquitinación de proteínas, los investigadores desarrollaron un modelo de corrección dinámica de moléculas TPD basado en el módulo Sim-Biology de MATLAB. Este modelo puede predecir el efecto de la permeabilidad de la membrana PROTAC en DC50 y DMax. También puede predecir la selectividad basada en la afinidad de PROTAC por la ligasa E3 y POI y la estabilidad del complejo ternario. Incluso puede predecir la PK y la PD de los PROTAC. Se predicen características. Además, el desarrollo del programa para el acoplamiento molecular PROTAC y el modelado de complejos ternarios también se ha llevado a cabo sobre la base de la plataforma MOE o Rosetta.

 

 

06 Discusión y perspectivas

Han pasado veinte años desde que se desarrolló PROTAC. Con el desarrollo de la proteómica, la tecnología de secuenciación, la química combinatoria y otras tecnologías, el proceso estándar de descubrimiento de PROTAC también tendrá cambios profundos. Al final del artículo, el autor de este artículo primero mira hacia el futuro proceso de descubrimiento de PROTAC. Hay dos puntos a destacar: 1. Las simulaciones por computadora se utilizan para predecir la generación de PPI y seleccionar escenarios de Linker adecuados, tales como: AlphaFold, ProsettaC, simulación dinámica, etc. Se utilizarán en el diseño preliminar de PROTAC. 2. Los avances en la tecnología de biología estructural (rayos X, microscopía crioelectrónica, etc.) proporcionarán una mayor comprensión de la estructura de los tres complejos originales.

Además, el autor de este artículo cree que la integración de PROTAC y otros campos de la tecnología (como la inmunoterapia) cambiará el panorama del campo TPD. Los estudios han demostrado que los péptidos producidos por el POI que degrada PROTAC pueden presentarse como antígenos para los receptores del MHC, mejorando el efecto de la inmunoterapia. Además, la combinación de PROTAC e inhibidores de puntos de control inmunitarios también mostró un efecto sinérgico.

En términos de métodos de administración, los PROTAC pueden aprender de los medicamentos ADC. Además, la nanotecnología y la tecnología de profármacos también contribuirán al suministro específico y la estabilidad metabólica de PROTAC.

Además de lo anterior, en la siguiente etapa del desarrollo del campo TPD, las siguientes direcciones también merecen atención: 1. Los ARN-PROTAC diseñados a base de imitadores de ARN de moléculas pequeñas se utilizan para degradar las proteínas de unión al ARN; 2. La selección por ribonucleasa Quimeras (RIBOTAC) degrada el ARN; 3. Tecnología TRAFTAC que utiliza el ADN como elemento de reclutamiento para degradar los factores de transcripción; Además, las colas moleculares covalentes basadas en productos naturales y moléculas pequeñas que pueden inducir la polimerización y degradación del BCL6 también deben recibir suficiente atención.

 

 

(fuente: internet, solo referencia)