¿Qué es la cromatografía líquida?

 ¿Qué es la cromatografía líquida?

 

¿Qué es la cromatografía líquida? La cromatografía líquida (LC) es una técnica cromatográfica que se utiliza para separar y analizar los componentes químicos de una mezcla en una solución para determinar si un componente específico está presente o no, y si es así, cuánto está presente.

Muchos de nosotros estaremos familiarizados con el formulario LC plano desde el comienzo de la escuela, marcando una marca de tinta negra en el papel de filtro, sumergiendo un extremo en agua y luego observando si los colores de los componentes de la tinta están separados. Sin embargo, la mayoría de las LC utilizadas en aplicaciones analíticas se basan en la cromatografía en columna, que será el tema central de este artículo. Como sugiere el nombre, la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es un análisis de alto rendimiento que utiliza una alta resolución cromatográfica para una separación eficiente.

Los componentes separados también se pueden separar usando un recolector de fracciones después de la detección como medio de purificación. La HPLC tiene una variedad de configuraciones diferentes, que se pueden usar para separar los componentes disueltos de biomoléculas proteicas grandes con pesos moleculares que van desde pequeñas moléculas semivolátiles hasta decenas de miles de kilodaltons. La cromatografía líquida es una técnica analítica muy popular, ampliamente utilizada en el monitoreo ambiental, la agricultura y la medicina.

 

¿Cómo funciona la cromatografía líquida?

Hay muchas configuraciones de sistema diferentes para cromatógrafos de líquidos, entre los cuales la separación más eficiente se realiza en instrumentos de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC). Esta tecnología se comercializó por primera vez en 2004 y se denomina cromatografía líquida de ultra alta resolución (UPLC). En resumen, debido a la distribución única de cada componente entre la fase móvil (Figura 1 (1) a continuación) y la fase estacionaria (columna) (Figura 1 (3)), el multicomponente soluble en la fase móvil líquida La mezcla esta separado.

Imagen Figura 1: Un diagrama simplificado de un cromatógrafo de líquidos conectado a un espectrómetro de masas (LC-MS). (1) Bomba binaria para fase móvil, (2) Válvula de 6 puertos y circuito de muestreador del muestreador automático, (3) Calentador de columna (4) Detector de espectrómetro de masas, (5) PC.

La fase móvil suele ser un disolvente, y la muestra se transporta y pasa por el sistema mediante una bomba de alta presión (Figura 1 (1)). También juega un papel vital en el proceso de separación.

Cargue una pequeña cantidad de muestra (1-100 µL) en el bucle de muestra (Figura 1 (2)) y luego inyéctela en la fase móvil a través de una válvula de seis puertos, que activará el inicio de la cromatografía. Después de la inyección de la muestra, bombee la fase móvil a la columna cromatográfica (Figura 1 (3)). Hay una variedad de longitudes de columna (30 a 250 mm) y diámetros internos (1 a 4,6 mm) para elegir, llenos de materiales de adsorción en fase estacionaria de diferentes actividades y tamaños de partículas (1,5 a 10 micrones de diámetro), que en conjunto determinan Eficiencia y selectividad de la columna. La columna se encuentra en el horno. A temperaturas más altas (45ºC), la viscosidad de la fase móvil disminuye, aumentando así su velocidad lineal. A su vez, se reduce el tiempo de ejecución y se mejora la resolución cromatográfica.

Los componentes de la mezcla que tienen una mayor afinidad por la fase móvil migrarán rápidamente a través de la columna cromatográfica, casi sin interacción con la fase estacionaria. Cuando la banda del componente sale o eluye de la columna cromatográfica, el detector (Figura 1 (4)) dará una respuesta proporcional a la concentración del componente. El tiempo entre la inyección y la detección se denomina tiempo de retención. Para un conjunto dado de condiciones cromatográficas, el tiempo de retención de los componentes será muy claro y se puede comparar con los estándares de identificación.

En la cromatografía de fase inversa, los analitos con menos polaridad se distribuyen preferentemente a fases estacionarias no polares y tienen tiempos de retención más largos. El sistema de adquisición de datos (Figura 1 (5)) registra la respuesta del detector en función del tiempo de retención en el cromatograma. Los picos registrados en el cromatograma (Figura 2 a continuación) generalmente se integran para determinar el área del pico, que es proporcional a la concentración de los componentes presentes en la muestra.

Figura 2: Salida de cromatograma de HPLC o LC-MS.

Después de que el inyector automático inyecta la muestra en la fase móvil, el proceso de separación se realiza en la columna cromatográfica. La selectividad del sistema cromatográfico tiene el mayor impacto en la resolución cromatográfica y debe personalizarse para la aplicación y el componente en estudio. La selectividad se puede cambiar cambiando la fuerza electroquímica de grupos funcionales químicos específicos en la fase móvil (diferentes disolventes) o en la fase estacionaria (cambiando el tipo de columna).

Teniendo en cuenta la fase móvil, hay dos modos de funcionamiento principales para elegir cuando se opera un cromatógrafo de líquidos, a saber, isocrático o de gradiente. El método isocrático utilizará la misma composición de fase móvil durante la ejecución cromatográfica sin cambios en la selectividad. El método de gradiente cambiará la composición de la fase móvil con el tiempo y, por lo general, se puede optimizar para aumentar la resolución cromatográfica o acortar el tiempo de ejecución.

La naturaleza química de la fase estacionaria fijada en la columna cromatográfica afectará la selectividad de esta técnica. La HPLC de fase inversa o UHPLC es la configuración de sistema más popular y utiliza una fase estacionaria no polar (como octadecilsilano (ODS o C18)) y una fase móvil polar (agua / metanol). Otras fases estacionarias de fase inversa incluyen octasilano (C8), que es menos hidrófobo que C18 y tiene un tiempo de retención correspondientemente más corto para analitos menos polares. Si se usa una columna cromatográfica funcionalizada con sustituyentes fenólicos, esto aumentará la retención de componentes fenólicos debido a su mayor afinidad.

El pH de la fase móvil tiene un efecto profundo en el tiempo de retención de los componentes iónicos y debe usarse durante el desarrollo del método. El tampón se puede utilizar para mantener el pH de la fase móvil dos unidades por debajo del pKa del componente iónico, que a su vez convierte su equilibrio de disociación en una forma neutra. La forma neutra del componente es menos polar, por lo que se puede controlar su tiempo de retención.

La cromatografía en fase normal es otro método de cromatografía líquida que separa los analitos en función de su polaridad. En realidad, se desarrolló antes de la introducción de la cromatografía líquida de fase inversa, pero no es muy popular. La fase estacionaria es polar en la cromatografía de fase normal y la fase móvil es no polar. Esto cambia las características de retención del sistema y los componentes no polares de la mezcla se eluyen primero con el tiempo de retención más corto.

Los analitos polares tienen una mayor afinidad por la fase estacionaria, seguida de un tiempo de elución más prolongado y un tiempo de retención más prolongado. Hay otros tipos de cromatografía líquida, incluida la cromatografía iónica, el par iónico, la exclusión por tamaño, la afinidad, y la lista es interminable. Además de la cromatografía de exclusión por tamaño, que puede separar analitos en función de su tamaño / forma o peso molecular, las otras formas de cromatógrafos de líquidos mencionadas anteriormente utilizan todos métodos químicos de fase móvil y fase estacionaria diferentes. Para que se separe un conjunto dado de componentes, la selectividad y la resolución cromatográfica alcanzables están definidas por la fase estacionaria y la fase móvil utilizadas.

Una vez que los componentes están separados, deben probarse. La elección del detector depende de los objetivos del método de la aplicación; Varias opciones tienen distintos grados de sensibilidad, especificidad, selectividad y rango dinámico lineal. El detector más popular es el detector ultravioleta visible (UV-Vis), que mide la absorbancia de la luz en una longitud de onda específica.

La longitud de onda se selecciona de acuerdo con el máximo lambda del componente a analizar, y la respuesta del detector es directamente proporcional a la concentración del componente específico. A medida que los componentes eluyen de la columna, su concentración en la celda de flujo del detector aumenta y disminuye, y luego se representan como picos cromatográficos (consulte la Figura 2). La tasa de recopilación de datos debe establecerse para recopilar al menos 20 puntos de datos en todo el pico. Como muchas técnicas cromatográficas,

La longitud y el diámetro interior de las tuberías utilizadas para interconectar los diversos componentes del sistema LC son fundamentales y deben mantenerse en un mínimo absoluto. Ninguna parte del sistema cromatográfico (ni la fase estacionaria) desde el inicio del circuito de inyección hasta el final de la celda de flujo del detector contribuye a una separación efectiva. Este volumen adicional en el sistema se denomina volumen vacío, y la difusión longitudinal adicional de los componentes separados en el vacío dará como resultado una pérdida de sensibilidad y una resolución cromatográfica reducida.

 

La evolución de HPLC a UHPLC

El desarrollo de UHPLC se debe en parte a las crecientes demandas de los analistas de una separación de mayor resolución de muestras cada vez más complejas y desafiantes. El principal avance para hacer que el rendimiento cromatográfico cambie en esta etapa es el desarrollo de empaquetamiento en fase estacionaria de menos de 2 micrones con una distribución de tamaño de partícula estrecha.

Las nuevas partículas producidas tienen las mismas funciones químicas que las fases estacionarias de HPLC comúnmente utilizadas, lo que garantiza que la selectividad del sistema cromatográfico se mantenga cuando se utiliza la misma fase móvil. Cuando se utilizan nuevos materiales de embalaje de menos de 2 micrones, el aumento de la eficiencia o el aumento del número de placas logra importantes ventajas de rendimiento.

Existen muchas ventajas al migrar métodos de HPLC a sistemas UHPLC, incluidos tiempos de ejecución más cortos, mayor resolución cromatográfica, mayor sensibilidad y menor consumo de solvente. Para utilizar la nueva columna UHPLC, se debe utilizar una bomba que pueda funcionar a una presión más alta para adaptarse a la contrapresión aumentada ejercida por las partículas más pequeñas en la columna. La celda de flujo del detector también debe actualizarse para tener un volumen interno más pequeño, que es necesario para la detección de bandas más estrechas de componentes eluidos de la columna. También es necesario aumentar la tasa de recopilación de datos en consecuencia para garantizar que haya suficientes puntos de datos entre los picos.

 

Espectrometría de masas líquida (LC-MS)

Se puede decir que la espectrometría de masas es el mejor detector que se puede usar junto con un cromatógrafo de líquidos, porque tiene alta sensibilidad, rango dinámico lineal, selectividad e incluso especificidad cuando se utilizan instrumentos con capacidades de resolución de muy alta calidad. La tecnología de espectrometría de masas se utiliza para determinar la relación masa / carga (m / z) de un componente o analito. A diferencia de la cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS), el proceso de combinar sistemas de cromatografía líquida con espectrometría de masas no es fácil y lleva muchos años de tiempo de desarrollo. La ionización por electropulverización (ESI) es la técnica de ionización más utilizada en la LC-MS en la actualidad, donde el proceso de ionización se lleva a cabo a presión atmosférica. Es difícil alcanzar la entrada de presión atmosférica de alto vacío requerida por el sistema de espectrómetro de masas.

 

¿Cómo leer los espectros de masas de LC-MS y qué le dice?

La ionización por electropulverización es una técnica de ionización muy suave, lo que significa que se observan muy pocos fragmentos durante la formación de iones. Para analitos básicos que generan moléculas protonadas [M + H] +, puede ejecutar en modo de iones positivos, y para analitos ácidos que generan moléculas desprotonadas [MH] -, puede ejecutar el sistema LC-MS en modo de iones negativos.

Es posible que los iones de fragmentos sean generados por el proceso de electropulverización, generalmente por disociación inducida por colisión (CID), para obtener información de identificación para la caracterización o analitos diana. La CID se puede realizar en la fuente de iones cambiando la diferencia de potencial aplicada al primer cono de muestreo o al cono del skimmer, o se puede realizar en la celda de colisión acelerando los iones en un gas de colisión como el argón.

La Figura 3 a continuación muestra una adquisición de LC-MS de barrido completo, donde las colisiones en la fuente causan disociación, lo que da como resultado una serie de iones de fragmentos característicos para cada componente separado de la mezcla. La relación masa-carga (m / z) se traza a lo largo del eje x, y la intensidad o abundancia relativa de iones se traza a lo largo del eje y. El eje z de la Figura 3 representa el tiempo de retención de los componentes separados. Cada pico cromatográfico analítico de referencia se analiza una vez con un espectrómetro de masas. Los iones clave del fragmento de diagnóstico se pueden utilizar para la identificación y la confirmación del ión objetivo.

Figura 3: Espectro de masas LC-MS de barrido completo, MS agrega una dimensión adicional de información.

 

Incorporar cromatografía líquida en múltiples dimensiones

Cuando se trata de mezclas complejas de varios componentes, es posible que no sea posible resolver cada componente en una línea de base porque los picos individuales eluyen de la columna. Si no se puede proporcionar la resolución cromatográfica debido a la falta de selectividad, el desarrollo y la optimización del método solo pueden ayudarlo a resolver el problema, y ​​puede ser necesario utilizar otras columnas selectivas para separar los componentes coeluidos.

La cromatografía multidimensional permite que los componentes de elución conjunta se transfieran a otra columna cromatográfica con una selectividad más adecuada mediante el método de "corte de corazón", de modo que la separación se pueda dividir en componentes de elución individuales. El sistema puede estar provisto de una válvula de transferencia que simplemente transfiera los picos coeluyentes en la primera dimensión o la columna cromatográfica después de la detección a la segunda dimensión para la posterior separación y detección de mayor resolución cromatográfica.

 

Purificación por cromatografía líquida semipreparativa

Al expandir el tamaño del sistema de cromatografía líquida y usar una columna con un diámetro interno más grande y funcionando a un caudal más alto, se pueden cargar más materiales en la columna. El sistema de cromatografía semipreparativa puede contener 100 mg de muestra. Luego use un recolector de fracciones para eluir los picos cromatográficos de la columna y recójelos en una botella de muestra separada. El detector activa el recolector de fracciones. El detector busca el punto de inflexión que indica el comienzo del pico en la línea base cromatográfica y luego recoge los picos de los componentes separados como fracciones puras. Luego, las fracciones separadas se pueden complementar con otras técnicas de análisis de espectrometría de masas, como la resonancia magnética nuclear (RMN), para caracterizar completamente la estructura del compuesto.

 

Ventajas y desventajas de la cromatografía líquida.

LC se usa comúnmente en varias aplicaciones. Sin embargo, no es adecuado para la separación y análisis de compuestos volátiles. Un método de cromatografía líquida analítica confiable solo puede lograrse cuando la presión de vapor de todos los componentes a separar es menor que la presión de vapor de la fase móvil. La cromatografía de gases es más adecuada para el análisis de compuestos volátiles.

Proporcione una variedad de diferentes columnas cromatográficas y disolventes, que pueden proporcionar una amplia gama de selectividad, que puede separar componentes con una amplia gama de polaridades. Las moléculas grandes y las moléculas pequeñas son igualmente aplicables a esta técnica. La capacidad de realizar separaciones efectivas a temperaturas relativamente bajas también hace que la LC sea una técnica de separación ideal para compuestos térmicamente inestables que se pueden descomponer en un cromatógrafo de gases.

 

Preguntas frecuentes sobre cromatografía líquida

La preparación de la muestra es la clave del éxito; Es muy importante que todas las muestras se filtren antes de cargarlas en el muestreador automático. Cuando se usa UHPLC, si la muestra no se filtra, el uso de una columna cromatográfica de partículas de menos de 2 micrones para una separación de alta eficiencia es propenso a obstruirse, lo cual es particularmente importante. Esto también es válido para la fase móvil, especialmente si se utiliza un búfer.

Es muy importante utilizar el disolvente o diluyente de inyección correcto para la muestra, y la concentración del disolvente debe ser igual o menor que la concentración de las condiciones iniciales de la fase móvil. Si se usa un solvente que es demasiado fuerte, se observará división de picos y mala reproducibilidad. Si el disolvente de limpieza utilizado en el inyector automático es demasiado fuerte, se pueden observar problemas similares.

Es probable que la fluctuación de la línea de base o la mala reproducibilidad del tiempo de retención del cromatograma adquirido se deba a un problema con la bomba (Figura 1 (1)) o el desgasificador de vacío. Si la bomba o el desgasificador de vacío se mantienen incorrectamente, la válvula de retención puede estar parcialmente atascada, causando fluctuaciones de presión. Estos problemas se pueden resolver asegurándose de que las tareas de mantenimiento preventivo se realicen de acuerdo con las pautas del fabricante para evitar tiempos de inactividad no planificados y un rendimiento deficiente.

 

 

(fuente: internet, solo referencia)